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1、1,酶工程,Enzyme Engineering,曹新志E-mail: ,TEL:13890062236,2,主要参考书, 郭勇主编，酶工程。北京：中国轻工业出版社，2002 罗贵民主编，酶工程。北京：化学工业出版社，2002 陈石根，周润琦编著，酶学。上海：复旦大学出版社，2001 郭勇，郑穗平编著，酶学。广州：华南理工大学出版社，2000,3,现代生物工程：,1.基因工程（gene engineering） 2.细胞工程（cell engineering） 3.酶工程（enzyme engineering） 4.发酵工程（fermentation engineering） 5.蛋白质工程（
2、protein engineering ）,4, 绪论 酶的工业生产 酶的分离纯化与制剂 固定化酶和固定化细胞 酶反应器 酶的非水相催化 酶制剂的应用,5,第一章 绪论 (ENZYME ENGINEERING),酶工程是现代生物技术的重要组成部分。 其特点是利用酶、含酶细胞器或细胞(微生物、植物、动物)作为生物催化剂来完成某些重要的化学反应。,1,6,第一节 酶工程概述 第二节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 第三节 酶作为催化剂的显著特点 第四节 影响酶活力的因素 第五节 酶动力学和抑制作用,7,生物技术的四大支柱,8,基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。 细胞工程：微观水平的嫁
3、接技术。 酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。 发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工 厂，将神话变为现实的桥梁。,9,第一节 酶工程概述一、酶与酶工程发展简史（一）酶学研究简史1. 不自觉的应用：酿酒、造酱、制饴糖、治病2. 酶学的产生: 消化与发酵现象,10,（1）消化 法国著名科学家雷默（1683-1757）认为消化是一个在胃液作用的化学过程而不仅仅是一个物理过程。 1777年，意大利物理学家 Spallanzani(斯帕兰扎尼) 的山鹰实验。证明在胃液中存在一些特殊的活性成分 1822年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化。 19世纪30年代，德国科学家施旺获
4、得胃蛋白酶。,11,（2）发酵 1684年，比利时医生Helment提出ferment引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）。 1833年，法国化学家Payen (佩恩)和Person(帕索兹)用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。 1878年，德国科学家Khne(库尼)提出enzyme从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。,12,小插曲 19世纪，Pasteur和Liebig学术长期争论:1857年，法国化学家和微生物学家Pasteur(巴斯德)认为没有生物则没有发酵。德国化学家Liebig认为发酵是由化学物质引起的。此争议由德国学者Buchner(巴克钠)兄
5、弟于1896年解决。,13,Buchner兄弟的试验：用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。 证明：发酵与细胞的活动无关。,14,15,酶活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质。 enzymeorganic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself.酶的化学本质？,16,3.酶学的迅速发展（理论研究） （1） 酶的化学本质 德国化
6、学家R.Willstatter的错误观点。 1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者” Sumner（萨姆纳）博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。并获得1947年的诺贝尔奖。 1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶，确立了酶的化学本质。,17,18,19,20,21,22,（2） 酶学理论研究 1890年，Fisher锁钥学说。 1902年，Henri中间产物学说。 1913年， Michaelis 和 Menten米氏学说。 1958年， Koshland诱导契合学
7、说。 1960年，Jacob 和 Monod操纵子学说。,23,Characteristics of enzyme active sites Lock and key model (锁钥)1890 picture by Emil fisher.This model assumed that only a substrate of the proper shape could fit with the enzyme. Induced fit model (诱导契合)proposed by Daniel Koshland in 1958.This model assumes continuous
8、changes in active site structure as a substrate binds.,24,25,中间产物学说,ES,P,S,E,26,Steps in an enzymatic reaction Enzyme and substrate combine to form a Complex. Complex goes through a transition state -not quite substrate or product A complex of the enzyme and the product is produced Finally the enzym
9、e and product separate All of these steps are equilibria. Lets review each step.,27,28,29,30,31,Michaelis-Menten equation,32,酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。是否所有的酶都是蛋白质？,33,（3）核酶的发现1982年，Thomas R.Cech(切克)等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶Ribozyme。1983年，Altman(阿尔特曼)等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tR
10、NA前体的催化功能。而RNase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。,34,核酶的发现，改变了有关酶的概念，即“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。酶分两大类：主要由蛋白质组成蛋白类酶（P酶）主要由核糖核酸组成核酸类酶（R酶）,35,（二) 酶工程研究简史（应用研究） 1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。 1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。 1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。 1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清
11、。,36,1949年，用微生物液体深层培养法进行淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。,37,在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只能使用一次，分离纯化困难等。解决的方法之一是固定化。,38,固定化技术的发展经历 1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性。1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L氨基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会
12、议的主题是固定化酶。,39,二 . 酶工程简介由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。分为：化学酶工程与生物酶工程。,40,化学酶工程（初级酶工程） 酶化学与化学工程技术相结合的产物。主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。 2. 生物酶工程（高级酶工程） 在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。,41,生物酶工程主要研究内容 （1） 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶） 如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓
13、病的有效药物。用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。 （2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶） 如：酪氨酰tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。 （3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。,42,43,酶工程原理和基本过程菌种 扩大培养 发酵 发酵酶液 酶的提取 酶成品原料 前处理 杀菌 酶反应器 反应液 产品提取 产品,酶的固定化,44,思考题： 酶工程的概念、分类及其研究内容。 Pay
14、en和Person、Buchner兄弟、Sumner、Fisher、Koshland、Henri、Michaelis和Menten、Jacob和Monod、Cech和Altmam及千佃一郎对酶学的主要贡献是什么？,45,应用范围包括:,医药、食品、化学工业，诊断分析和生物传感器等。诸如糖化酶、淀粉酶、洗涤用酶以及与-内酰胺抗生素生产有关的青霉素酰化酶、7-ACA酰化酶等，其市场需求、生产规模和产值均很可观，并已产生巨大的经济效益。随着酶的大量应用，各种酶反应器和固定化技术应运而生，更进一步地推动了酶工程的发展。,46,当代酶工程发展的趋势之一,是寻找耐极端条件的酶，如耐高温、耐酸碱、耐盐等。这
15、些酶存在于嗜高温、嗜酸碱、嗜高盐的细菌中。近年来对这些细菌的研究进展迅速，这将为酶工业提供源源不断的新型酶类。,47,酶有多少种?,现已发现生物体内存在的酶有近8000种，而且每年都有新酶发现。迄今，数百种酶已纯化达到了均一纯度，大约有200多种酶得到了结晶。由于蛋白质分析分离技术的飞速发展，特别是在运用x射线衍射分析等方法后，人们相继弄清了溶菌酶(129个氨基酸残基)、胰凝乳蛋白酶(245个氨基酸残基)、羧肽酶(307个氨基酸残基)、多元淀粉酶A(460个氨基酸残基)等的结构和作用机理。现在对于细胞基本代谢过程中的各种酶，很多已有比较清楚的认识，但有关遗传过程中的酶还有待深入研究。,48,酶
16、是生物体内进行自我复制、新陈代谢所不可缺少的生物催化剂。由于酶能在常温、常压、中性pH等温和条件下高度专一有效地催化底物发生反应，所以酶的开发和利用是当代新技术革命中的一个重要课题。酶工程主要指自然酶制剂在工业上的大规模应用，由4个部分组成： 酶的产生； 酶的分离纯化； 酶的固定化； 生物反应器。,49,酶工程的发展历史:,一般认为，酶工程的发展历史应从第二次世界大战后算起。 从20世纪50年代开始，由微生物发酵液中分离出一些酶，制成酶制剂。 60年代后，由于固定化酶、固定化细胞崛起，使酶制剂的应用技术面貌一新。 70年代后期以来，由于微生物学、遗传工程及细胞工程的发展为酶工程进一步向纵深发展带来勃勃生机，从酶的制备方法、酶的应用范围到后处理工艺都受到巨大冲击。尽管目前业已发现和鉴定的酶约有8000多种，但大规模生产和应用的商品酶只有数十种。 。,
