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1、基因生物的蛇白质水年林实验目的:学习转基因生物的虾白质水平检测方法一一蛋白质提取及检测技术,包括全虾白的提取和垂直板电泳。实验要求.掌握外源基因的表达情况的检测方法,掌握蛋白质的提取及电泳花术。了解垂目枢电泳槽的使用方法和聚丙烯酰胺凝胶的配制。技术应用:转基因生物外源基凶鞭蛋白的分离及纯化。的表达检测及目的*实验材料:转基因工程菌及受体菌BL21。*试剂:IPTG;酶母提取液;胰蛋白胡;NaClL:Tris-HC1(Ph6.8);SDS;甘油;DTT;“CBB-R250;甲叉双丙烯酰胺(Bis);丙烯酰胺Acr);“SDS;丙三醇;B-巯基乙醇;溴酚兰;过硫酷铨AC)IEMED;乙陶;冰醋酸;
2、甘油;甘氨酸=实验原理1.载体介绍:、克隆载体:T-vector,pUC19,.pBR322等等;表达载体:pET系列启动子终止子原核表达嶂坳夷计根据启动子的转录模式可将其分为3类:组成型启动子组织或器官特异性启动子鞭二秀导型启动子。Ann1T94Scal1875史旦1sianApal14绍肉8|前hcol多1Sacll|6一spal驯00825gatz1|驱R56Sal56Aoel82Sac|刹ofs1103hT1Ers|Figure2.pGEWE.TVectorcirclemapandsequencereferencepoints:原核表达载体河酶刹巽m)芸菖哺0国T7终止t孔ues-|医
3、盛DantenanMXialeaa诚一一SphttoaT7朋动子RolcaoSoritcaSmaleaootn菖一Balonn河d驭|jassnesePET-28a1+)英门Mapalosey悟一BeshoasmEcos7len1EcoRvesraHpainezAwuieceoRBssslcson2eBspuuressgJagrirsza一一-EpaleugFsplcsaaPspsssNOS是胭脂砾合成酶的终止子的简真核表达载体“湘EcoaI花楞菜花叶病毒(CCaMV)35S肩_动子玉米Ubiquitin臭动子TB一一P1300.GUS11956bp、2-蛋白检测:、“对转基因生物中外源基因是
4、否表达的最直接的方法就是检测是否有目的蛋白出现,在对目的蛋白的分子量,等电点等有所了解的基础上对转基因生物的总蛋白进行提取,通过电泳检测目的蛋白是否出现,从而可以知道外源基因是否表达。=实验流程.1.细菌全蛋白的提取:.茧液摇培过夜一一IPT6诱导表达6-9小时(t2,000rpm,30秒)(3次)一一加100hI裂液一一振荡,摇匀,加热变性一一离心,(12,000rpm,30秒)一一加TE稀释后取上清点样12-裂解液配方,Q.0625MTris-HzI(ph6.8);2%Sbs;10%甘油(gLyceroil);0.1MDTT:;0.01%CBB-R250。=2.细菌全虾白的SDbS-PA6E*电泳条件:浇缩胶电压为80V,离胶后120V稳压电泳。蓝距离边缘1一2Ecm。=电泳时电泳:进入分间为溴酚说明1.虾白质(包括酶)的提取方法依据虾于水、稀盐、稀酸或碱溶液,类结合的蛇白质则溶F乙醇、醇等有机溶剂中,因些,可采剂提取分离和纯化虾质及酶。=质都可溶少数与脂丙酮、丁用不同溶
