细菌内毒素检查法2

《细菌内毒素检查法2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌内毒素检查法2（35页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、细菌内毒素检查法,2005年版中国药典细菌内毒素定量检查法修改草案 细菌内毒素光度法（定量法）实验技术 细菌内毒素光度法测定供试品的应用实例 动态浊度法鲎试剂的使用说明 定量法的应用举例,一、2005年版中国药典细菌内毒素定量检查法修改草案,方法 光度测定法（定量测定法）光度测定法分为浊度法和显色基质法。,浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光

2、度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。,显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。,光度测定试验应在特定的仪器中进行，温度一般为37土1。 为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。试验环境中发生了任何可能影响检验

3、结果的改变时，试验的有效性应重新检验。,标准曲线的可靠性试验,用标准内毒素配成溶液并制成至少3个浓度的稀释液(稀释度不得大于10)，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照在设定的反应时间内不发生反应，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。,干扰试验,选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明

4、进行。每种溶液至少做2个平行管。,表1 光度测定法干扰试验溶液的制备,注A：稀释倍数未超过MVD的供试品溶液。B：加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供试品溶液。 C：如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒 素溶液。 D：阴性对照。,按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。Cs-CtR = X100入m 当内毒素的回收率在50200之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。 当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验

5、”中的方法去除干扰因素。并要重复干扰试验来验证处理的有效性。,检查法,按“光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。试验必须符合以下三个条件方为有效，(1)系列溶液C的结果要符合“光度技术预试验”下的“标准曲线的可靠性试验”中的要求。(2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50200的范围内。(3)溶液D(阴性对照)在规定的反应时间内应未检测出内毒素。若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定

6、。,二、细菌内毒素光度法（定量法）实验技术,（一）光度（定量）检测的方法学 定量测定细菌内毒素的光度法，是目前世界医学卫生领域开展的一项灵敏度高和专一性强的检查方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法。光度测定法包括浊度法和显色基质法。2000年版定量法以指导原则的形式收载入药典,而指导原则是为执行药典、考察药品质量所制定的指导性规定，不作为法定标准。但在2005版将光度测定法收入了药典附录，提高了定量法的地位。也就是说，在供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。,定量法与凝胶法比较有许多优点：,1. 定量分析法能直接测出样品溶液中的内毒素实际含量。 2. 做干扰实验一两次

7、试验即可完成，节约了成本，样品中内毒素的含量，对干扰试验的回收率基本无影响 3. 光度（定量）法比凝胶法的最低检测限要低，可选择更大的稀释倍数来排除样品的干扰； 4. 反应曲线直观的反映出反应过程，可通过反应曲线判断该反应是否为内毒素。 5. 细菌内毒素单位（EU）、细菌内毒素工作标准品的用途、实验所用器皿的处理、供试液的制备、内毒素限值的建立光度法和凝胶法是一致的。但最大有效稀释倍数（MVD）的确定光度测定比凝胶测定稀释倍数更大。,（二）光度测定法的分类：,细菌内毒素光度检测法包括： 1、 浊度法：动态浊度法、终点浊度法。 2、显色基质法：动态显色法、终点显色法。,浊度法：系利用检测鲎试剂与

8、内毒素反应过程中浊度变化而测定内毒素含量的方法。 a.终点浊度法 依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度和透光度）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。 b.动态浊度法 检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。,显色基质法：系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊低物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素含量的方法。 动态显色法 检测反应物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的时间，或是检测色度增长速度 的方法。 终点显色法依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内

9、毒素含量的方法。上述方法，常用的为动态浊度法。 以上几种方法，常用的为动态浊度法。,（三） 动态浊度法数学模型的建立 固定参数：吸光度变化值（OD） 自变量：内毒素C 因变量：反应时间Tg 函数：f（lgC，lgTg） 函数关系式：lgTg = a b lgC,（四）其他方法,罗氏蛋白染色法 荧光偏振法 I135数标记法 免疫火箭电泳法 ELISA法 细胞因子测定法其中ELISA法、细胞因子测定法和鲎试验的浊度法、比色法是在药品检验领域比较成熟，且是广泛使用的细菌内毒素定量法。,三细菌内毒素光度法测定供试品的应用实例,参照（中国药典2000年版 二部 附录XIX F细菌内毒素检查法应用指导原则

10、及2005年版中国药典细菌内毒素检查法修改草案）,(一)实验材料及用具,1细菌内毒素标准品 除另有规定外实验中所用细菌内毒素标准物质应由中国药品生物制品检定所研制、标定和分发。 2. 细菌内毒素检查用水 用于细菌内毒素定量测定的细菌内毒素检查用水，含内毒素的量应小于0.005EU/ml。 3鲎试剂 应符合定量测定要求，灵敏度至少为0.06EU/ml。 4天平 供试品称量用，感量为0.1mg以下。 5电热干燥箱 除外源性内毒素用，温度应能维持250以上至少一小时。 6. 恒温水浴箱或适宜的恒温器 应在371保持一小时。 7. 水银温度计或酒精温度计 精度在1以下。 8. 旋涡混合器 9BET32

11、型细菌内毒素测定仪 10实验用具 移液管（或刻度吸管、定量移液管）、凝集管（特定）、三角瓶、小试管（16100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。 11. 试剂 75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。,（二）、标准曲线的有效性考察,首先用BET水将内毒素工作标准品稀释到10EU/ml、1.0EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml备用，然后将复溶好的定量法鲎试剂分装到14支定量分析专用试管中，每管分装0.1ml，接着将内毒素加入定量分析专用试管中，每个浓度做3支平行管，每管加量0.2ml，剩下两管各加入BET水0.2ml作阴性对照。操作过程参考中国生物

12、制品规程389页细菌内毒素检查法。 线性方程：Log=3.0329-0.2536LogC，相关系数：r=-0.9923，标准曲线符合规定。,（三）、供试品干扰实验,1. 最大有效稀释倍数的确立 根据中国药典2005年版征订稿提供的公式计算最大有效稀释倍数选用光度法鲎试剂的最低检测限为0.005EU/ml,但在这里是指所用标准曲线的最低内毒素浓度为0.01EU/ml，本样品为液体故则C=1。计算方法如下： MVD=CL/=15.0/0.01=500倍,2按下表制备光度法干扰实验的各种溶液,将复溶好的光度法鲎试剂分装到12支定量分析专用试管中，.每管分装0.1ml，接着将制备好的各种样品溶液加入定

13、量分析专用试管中，每个做2支平行管，每管加样量0.2ml。操作过程参考中国生物制品规程 细菌内毒素检查法。,（1）、定量法干扰试验的溶液具体制备方法： a) 取供试品的20倍稀释液0.5ml加入试管中，然后取相同体积的内毒素标准溶液（2EU/ml）加入同一支试管中，混合均匀即可得含内1EU/ml的样品供试品的40倍稀释液。 b) 取供试品的40倍稀释液0.5ml加入试管中，然后取相同体积的内毒素标准溶液（2EU/ml）加入同一支试管中，混合均匀即可得到含内毒素为1EU/ml的样品供试品的80倍稀释液。,（2）、试验结果及分析： 鲎试剂：批号：030702 规格：0.5ml/支 厂家：湛江海洋生

14、物制品厂,线形回归方程LogT=3.0329-0.2536LogC，计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R），以40倍稀释液的干扰试验为例：R=（Cs-Ct）/m100%=(0.9820-0.0820)/1.0100%=90% 当内毒素的回收率在50200%之间，认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。 由以上试验数据，供试品的40和80倍稀释液的回收率分别为90%、96.6%，可以判断供试品的40和80倍稀释液对鲎试剂没有干扰作用。,3.供试品细菌内毒素检查,采用动态浊度法对样品做定量细菌内毒素检查。选定建立标准曲线的内毒素浓

15、度分别为10、1、0.1EU/ml三点。根据干扰试验的结果，把样品稀释40倍进行动态浊度试验。 （1）标准曲线制备： 取内毒素标准品（批号2003-12），1支，按标示效价稀释为10、1、0.1 EU/ml。取浊度法定量鲎试剂（批号040519）内毒素系列浓度分别在BET-32型动态试管仪反应，每一浓度重复两管，各动态反应曲线见图3，标准曲线见图4。,（2） 样品检查：取样品稀释40倍，记为T。取鲎试剂（040519）复溶后分别加入特定的试管中，再将样品稀释液加入试管中分别在BET-32型动态试管仪上反应，每一浓度重复两管，同时做两管PPC观察回收率。各样品的动态反应曲线见图5。 （3） 结果

16、分析：定量细菌内毒素检查法要求：1）标准曲线的相关系数r0.980； 2）回收率要求在50200%之间；3）NC（阴性对照）的内毒素含量小于标准曲线的最低点浓度。本实验的标准曲线的相关系数r=0.99822，内毒素的回收率为104.7%，NC的内毒素含量0.005EU/ml,各项条件符合规定，因此，实验有效。,四.动态浊度法鲎试剂的使用说明,成份：本品为东方鲎阿米巴细胞溶介物，冷冻干燥制品，含有一定量的一价及二价阳离子，缓冲剂和稳定剂。定量法鲎试剂不同于凝胶法鲎试剂，它对鲎血细胞提取物的纯度、溶解度、澄明度以及对内毒素反应的线性关系都有较高要求。定量法鲎试剂的标示值表示定量鲎试剂的最低检测限，而不是灵敏度，其标准曲线是用细菌内毒素国家标定。活性单位用EU/ml标示。,