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1、免疫组化基本技术（三）,6.根据本实验室经验各种不同类型组织 的石蜡包埋条件 (1)大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间,75乙醇30120min，85乙醇30120min，95乙醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇过夜，无水乙醇3060min，无水乙醇3060min，无水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可视观察结果而定），石蜡30min，石蜡12h，石蜡23h。,(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h，1h，过夜或2h，无水乙醇、和各30min，二甲苯15min, 10min，10min（肉眼观察），石蜡30
2、min，石蜡30min，石蜡12h。,(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间 75乙醇30min，85乙醇1h，95乙醇1h，1h和4h或过夜，无水乙醇30min，12h和4h，二甲苯30min，30min和1h。,七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。,1.切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。,(2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅
3、烷）：干净载玻片丙酮5min APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。,铬矾明胶液： 铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml 甲醛明胶液： 40甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml,2.石蜡切片： 3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机),4.切片要求及注意事项： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4保存数年（石蜡切片）,(7)冰冻切片需凉干后立即固定
4、(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理24h，冰冻切片。 (9)冰冻切片固定后-80保存备用,八、组织与细胞材料的保存 1.冷冻保存： -80，-145，-198 组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。,2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80冻存。 3.蜡块的保存 4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。,第二部分 IHC的一些基本技术,主要内容 一、实验的设计 二、石蜡切片的脱蜡至水 三、内源性酶的消除方法 四、IHC的非特异性染色 五、抗原的
5、暴露和修复 六、抗体的购置及注意事项 七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制 九、IHC常用缓冲液,一、实验的设计 1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。,2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前 处理方式。 3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度， 应设置何种对照。,4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育 时间和温度，同一的显色时间。 5.列出阳性判定的标准 6.预期达到的目标,二、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从-80取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。,二甲苯10min，二甲苯10min，二甲苯10min，无水乙醇2min，95乙醇2min，85乙醇2min，75乙醇2min，流水冲洗。,三、内源性酶的消除方法 (一)内源性过氧化物酶的消除方法： 1. 0.3%3%H2O2甲醇液20min 2. 1 H2O2 20min 3. 3苯肼溶液 37 1h 4. 0.075%盐酸甲醇液 30min,5.DAB-H2O2溶液中加0.005M NaN3 过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min， 经洗后1硼酸钠处理10min。 7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸3060min。,
