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1、阳性克隆的PCR鉴定,一、实验目的 掌握利用PCR技术对阳性克隆的检测技术掌握PCR技术的原理和方法,DNA聚合酶Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但此酶不耐高温。现今所使用的酶( Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。 PCR于1983由K. B. Mullis发展出的，Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以
2、说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。,二、相关基本知识,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。,1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。,
3、PCR产物生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；对细菌的最小检出率为3个。,PCR不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品即可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,PCR反应体系,引物 dNTP Mg2+ Taq聚合酶 模板 反应缓冲液,引物设计的基本原则：,引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。,引物序列3端出现3个
4、以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。,引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，两条引物3端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。,5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。,引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应，因为GC含量决定了DNA双链的解链
5、温度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。,一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。,dNTP应用NaOH 将pH调至7.0。 dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装, -20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。理论上4 种 dNTP各20mol/L, 足以在100l反应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性. 4种dNTP的浓度应该相等, 以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。,dNTP,PCR反应体系- M
6、g2+,Mg 2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大, 它可影响酶的活性和真实性, Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性; Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。 Mg 2+浓度还影响引物退火和解链温度以及引物二聚体的形成等。 通常Mg 2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L, 1.5mM最佳。,PCR反应体系- Taq聚合酶,扩增效率最高, 1000 bp/min 活性 5-3 DNA聚合酶活性 强 无3-5 DNA外切酶活性 错配率每个循环约1/6000 3末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆,pfu酶保真度高 原理: 具35核酸外切酶活性，即校正功能。 效率相对较低, 5
7、00 bp/min 3末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。,就模板DNA而言, 影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度. 一般反应中的模板浓度为 50-100 ng/ml. 模板量过多则可能增加非特异性产物. DNA中的杂质也会影响PCR的效率.,PCR反应体系-模板DNA,PCR反应体系 PCR反应缓冲液,缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg 2+ . 另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性。 加入T4噬菌体的基因32蛋白，对扩增
8、较长的DNA片段有利。,PCR反应参数:变性,在第一轮循环前,在94下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的 DNA双链会很快复性,减少DNA产量。 对于富含GC的序列,可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,PCR反应参数:退火,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5，时间一般为30-45sec。,PCR反应参数:延伸,延伸反应通常为72,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸
9、在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20-85. 一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30 min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,PCR反应参数:循环次数,当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。,PCR反应程序:,三、实验材料、器具及药品
10、,实验器具 微量取液器(10l, 20l)， 台式高速离心机，PCR仪。,实验材料待检测的阳性克隆菌株.,实验药品10PCR缓冲液(含Mg2) dNTP (每种2.5mmol) Taq酶 2U/ul DNA模板 引物M13-R: 5- CAGGAAACAGCTATGAC-3(Tm=52) 引物M13: 5-GTAAAACGACGGCCAGT-3 (Tm=53.4 ) 引物溶液浓度 10pmol/ul,四、实验步骤,在0.2ml RCR管内配置20ul反应体系：,混匀后离心，进行PCR扩增.(94预变性5min，94变性30sec，50退火30sec，72延伸30sec,循环30次,72延伸10min。),扩增产物进行电泳检测:,
