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1、105】105】乳腺癌乳腺癌 HER2HER2 检测指南检测指南(2014(2014 版版) )概要概要2014-09-01 四川病理来源：中华病理学杂志来源：中华病理学杂志正确检测和评定乳腺癌乳腺癌的 HER2 蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重要。HER2 检测结果不仅涉及患者是否适合针对 HER2 的靶向治疗，并且对内分泌治疗、化疗方案的选择及预后评估起指导作用。乳腺癌 HER2 检测指南(2014 版)结合我国实际情况，在乳腺癌 HER2 检测指南(2009 版)的基础上，补充相关领域的新内容和新观点。现摘选其检测方法部分如下。一、检测方法检测方法推荐采用免疫组织
2、化学(IHC)法检测 HER2 受体蛋白的表达水平，应用原位杂交(in situ hybridization，ISH)法检测 HER2 基因扩增水平。ISH 包括荧光 ISH ( fluorescence in situ hybridization，FISH)和亮视野 ISH。常用的亮视野 ISH 方法有显色 ISH(chromogenic in situ hybridization，CISH)和银增强 ISH(silverenhanced in situ hybridization，SISH)。本指南推荐 IHC 与 ISH 相结合的检测策略。二、检测时机及临床病理联系检测时机及临床病理联系
3、所有乳腺原发性浸润癌都应进行 HER2 检测。只要能获取肿瘤组织，对复发灶或转移灶也应该进行 HER2 检测。如 HER2 检测结果为不确定，则应使用另一种检测方法进行检测，或对该患者的其他样本进行检测。加强临床病理沟通有助于对 HER2 检测结果的正确诠释和对 HER2 靶向治疗疗效的客观评价。临床医师和病理医师均需注意 HER2 检测结果是否与组织病理学特征相符，如组织学分级为 1 级的浸润癌通常为 HER2 阴性，包括浸润性导管癌、经典型浸润性小叶癌、小管癌、黏液癌、筛状癌、腺样囊性癌等。如检测结果为阳性，则视为检测结果与组织病理学特征不符合，需要核实诊断或重新检测。三、HER2 检测流
4、程检测流程乳腺癌标本一般可先经 IHC 检测。IHC 3+为 HER2 阳性，IHC 0 和 1+为 HER2 阴性。IHC 2+为 HER2 不确定病例，需进一步应用 ISH 的方法进行 HER2 基因扩增状态检测，也可以选取不同的组织块重新检测或送条件更好的实验室进行检测。四、组织标本的制备组织标本的制备1标本类型：(1)手术切除标本；(2)粗针穿刺活检标本；(3)麦默通活检标本。2标本固定：所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定(1 h 内)。固定时应将标本每隔510 mm 切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以 672 h 为宜。3固定液类型：4中
5、性(磷酸缓冲)甲醛固定液。4组织切片：(1)未染色的切片置于室温不宜超过 6 周，以防抗原丢失。(2)用于 IHC染色者切片厚度以 35m 为宜，ISH 法以 45m 为宜。(3)完成检测的切片，IHC 和亮视野 ISH 可按常规长期保存，FISH 结果应立即照相存档并于一 20保存，建议至少保存3 个月备查。(4)各种检测方法均应有 HE 染色切片作为对照。五、染色要求与结果判读染色要求与结果判读建议使用我国食品药品监督管理总局认证的检测试剂盒，对自行组配的检测系统则必须经过严格的内、外部质量控制，建立完善的实验室标准操作程序(SOP)，并与权威机构批准的检测试剂盒进行比对，以保证检测结果的
6、可靠性。(一) IHC1观察程序：应先在低倍镜下观察整张切片，判断染色是否满意及是否存在 HER2表达的异质性。正常乳腺上皮不应出现强的细胞膜着色。只评定浸润癌的着色情况，导管原位癌的着色不能作为评定对象。观察细胞膜着色的浸润癌细胞的比例及着色强度，若出现细胞质或细胞核着色提示 IHC 染色效果不理想或组织处理不佳，建议调整染色条件或更换组织后再行染色。判读时应避开组织边缘及组织处理不佳(如明显挤压)的癌组织。2结果判读及注意事项：结果判读标准(按每张切片计；图 1，2)：0：无染色或10的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1+：10的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2+：有
7、两种情况，第一种为10的浸润癌细胞呈现不完整和或弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为10的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；3+：10的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。对于 2+的病例，应该用 ISH 做进一步检测，也可以选取不同的组织块重新检测或送条件更好的中心实验室进行检测。当出现下列情况时 HER2 状态为无法判读(indeterminate)，包括标本处理不当、严重的组织挤压或边缘效应、检测失败等。应在报告中注明 HER2 状态无法判读的可能原因，并建议再次获取样本进行 HER2 检测。在乳腺浸润性微乳头状癌和部分有分泌现象的乳腺癌中，有时浸润癌细胞的细胞膜已呈很深的棕褐色，但却并
8、未呈闭环状完整着色，存在一定程度的不连续性和间断胜，此时至少应视为 HER2 2+，并需要行 ISH 检测进一步明确 HER2状态。建议在 HER2 IHC 检测报告中包括如下内容：患者信息(包括姓名、性别、年龄、门诊住院号)、送检医师姓名、送检日期、标本信息(包括病理号和蜡块号)、标本部位和类型、抗体信息(克隆号生产商)、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果(O、1+、2+、3+)、检测结论(如阳性、不确定、阴性、无法判读)。3质量控制：包括抗体的选择、抗原修复方法、染色及其他相关实验室技术，均应严格按 SOP 进行。IHC 自动染色系统更易达到标准化，但也
9、应进行严格的比对试验和程序优化，且需要对机器进行定期维护。IHC 染色须设立对照，以不同染色程度的组织芯片作为对照为最佳。被检测切片中癌旁正常乳腺上皮细胞是很好的阴性内对照。利用计算机图像分析有利于判断的准确性和可重复性，但必须经过病理医师确认其结果，且设备使用前必须进行校验。(二) FISHFISH 技术通过荧光标记的 DNA 探针与细胞核内的 DNA 靶序列杂交。在荧光显微镜下观察并分析细胞核内杂交于 DNA 靶序列的探针信号，以获得细胞核内染色体(或染色体片段)上基因状态的信息。目前进行 HER2 基因状态检测的探针多为同时含有 HER2 基因和该基因所在的第 17 号染色体着丝粒(CE
10、Pl7)序列的双探针，也可采用仅含有 HER2 基因的单探针。1观察程序：应在低倍镜下观察整张 FISH 切片，初步判断检测质量以及是否存在HER2 扩增的异质性。要求至少找到 2 个浸润癌区域，计数至少 20 个浸润癌细胞。也可以参照 IHC 切片先确定可能存在扩增的浸润癌区域，然后于 100 倍物镜下通过特异通道滤光片观察 HER2 和 CEP17 信号，并进行信号计数和比值计算。2结果判读及注意事项：应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少 20 个浸润癌细胞核中的双色信号。在观察信号时，应根据情况随时调节显微镜的
11、焦距，准确观察位于细胞核不同平面上的信号以免遗漏。判读标准(图 35)：双探针 ISH：(1)当 HER2CEP17 比值2.0 时，为 HER2 阳性；HER2CEP17 比值4.0 时为 HER2 ISH 结果不确定。单探针 1SH：肿瘤细胞平均 HEt2 拷贝数细胞10的荧光信号位于细胞核外；细胞核结构难以分辨；有强的自发荧光。(2)外对照：应选择已知 FISH 阳性和阴性的标本片(或采用厂家提供的对照片)作为外对照，且杂交染色结果与预期相符。(3)如有可能，建议设置低扩增对照。4关于第 17 号染色体数目：FISH 双探针检测中加入 CEPl7 探针的目的是为了在检测 HER2 基因的
12、同时检测第 17 号染色体数目，从而将第 17 号染色体的非整倍体和单纯的HER2 基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。但近年来的研究显示整条第 17 号染色体的多体罕见，CEP17 的多体并不能代表整条第 17 号染色体多体。部分乳腺癌中第 17 号染色体存在 HER2 基因和着丝粒的共同扩增。越来越多的学者认为，与 HER2CEPl7 比值相比，HER2 拷贝数对于 HER2 基因扩增的判断更为重要。因此在 HER2 FISH 检测结果中除报告 HER2CEPl7 比值外，还应分别报告 HER2 拷贝数和 CEPl7 的数值。5关于 HER2 基因的异质性：浸润性乳腺癌中 HER2 表达或
13、扩增可存在异质性。虽然 HER2 基因异质性的临床意义目前仍不明确，但它可导致 IHC 与 ISH 检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致。在 ISH 计数之前，应观察整张切片或使用 IHC 确定可能存在 HER2 扩增的区域。需要强调的是，即使存在异质性，但只要扩增细胞连续、均质，且占浸润癌 10以上，就应明确报告为 ISH 阳性。可补充报告不同细胞群(10)的计数值(包括计数的细胞总数、HER2 拷贝数、CEPl7 数值、HER2CEPl7比值)，并报告扩增细胞群占所有浸润癌细胞的比例。(三) SISHSISH 中目前运用最广泛的是双色银染 ISH(dualcolor
14、insitu hybridization，DISH)。在此检测中通过二硝基苯(DNP)标记的探针检测 HER2，并利用银染 ISH DNP 染色液进行显色。用地高辛标记探针检测 CEPl7，采用地高辛红染显色液。DISH 可在光镜下观察结果，其中 HER2 在肿瘤细胞的细胞核中表现为黑色信号，CEPl7 为红色信号。也可采用仅针对 HER7基因的单探针 SISH。1，观察程序：结合 HE 染色，选定含有浸润性乳腺癌的靶区进行观察。选定区域内的大部分细胞需同时显示黑色和红色信号，且这些信号没有被非特异性背景染色覆盖。计数至少 20 个浸润癌细胞。在 4 倍物镜下扫描整张切片，观察是否存在 HER
15、2 表达的异质性以及标本质量。然后于高倍镜(40 倍或 60 倍物镜)下观察结果并进行信号计数和比值计算。2结果判读(图 46)：(1)应选择细胞核大小一致、核的边界完整、细胞核无重叠、红色和黑色两种信号清晰的细胞。随机计数至少 20 个浸润癌细胞核中的双色信号。(2)当存在 HER2 信号簇时，可根据单个拷贝大小估计拷贝数。判读标准：参见 FISH，如果最终结果为不确定，则需要再计算 20 个细胞核中的信号或由另外一位分析者重新计数。如结果仍为不确定，则应行 IHC 检测(若 SISH 前未行)，也可以选取不同的组织块重新检测。报告格式可参照 FISH 检测。图 2AD 浸润性乳腺癌 HER
16、2 免疫组织化学染色结果中倍放大；2A 示 HER2 0，2B 示 HER2 l+，2c 示 HER2 2+，2D 示 HER2 3+图 3A。B 浸润性乳腺癌 HER2 双探针荧光原位杂交(FISH)检测结果，3A 示 FISH 阳性，3B 示 FISH 阴性 FISH 高倍放大图 6A，B 浸润性乳腺癌 HER2 双色银染原位杂交(DISH)检测结果，6A 示 DISH 阳性，6B 示 DISH 阴性 DISH 高倍放大图 7A，B 浸润性乳腺癌 HER2 品色原位杂交(CISH)检测结果，7A 示 CISH 阳性，7B 示 CISH 阴性 CISH 高倍放大3质量控制：(1)内对照：可以乳腺组织中的正常细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细胞)的 HER2 信号和 CEPl7 信号作为内对照。出现下列情况时应视为检测失败，包括：对照未出现预期结果；难以观察到至少两个浸润癌区域并计数；缺乏红色染色或黑色染色；斑点伪影干扰计数；严重消化过度或
