荧光光谱基础知识

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1、紫外可见分光光度法,仪器分析第十二章,ultraviolet-visible spectrophotometry,分光光度法的特点,(1) 测定的灵敏度高。常用于测量质量分数为 10-3 1的微量组分，甚至可测定质量分数低至 10-5 10-4的痕量组分。 (2) 测定的准确度高。一般吸光光度法测定的相对误差为2 5，若使用精密仪器,相对误差可降至1 2，完全可以满足微量组分测定的要求。,(3) 仪器设备简单，操作简便、快速，选择性好。由于新的显色剂和掩蔽剂不断发现，提高了选择性，一般不需分离干扰物质就能进行测定。 (4) 应用广泛。几乎所有的无机离子和具有共轭双键的有机化合物都可以直接或间接

2、地用吸光光度法进行测定。,分光光度法的特点,一、紫外可见吸收光谱,(一) 分子吸收光谱,1. 分子的能量,En ：分子内能； Et ：分子内能； Ev ：分子振动能； Er ：分子转动能； Ee ：价电子运动能；,(一) 分子吸收光谱,在一般化学反应中， En不变； Et 较小且不具有量子化特征；它们的改变不会产生光谱。,因此，分子具有电子能级、振动能级和转动能级。,电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。,(一) 分子吸收光谱,(一) 分子吸收光谱,(1) 电子能级跃迁 所需的能量较大，其能量在120eV，

3、产生的吸收光谱主要处于紫外可见光区(200780nm) ；,(2) 振动能级跃迁 振动能级的能量差约为0.0251eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振转光谱；,(一) 分子吸收光谱,(4) 吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据；,(3) 转动能级跃迁 振动能级的能量差约为0.0250.003eV，跃迁产生的吸收光谱位于远红外区,远红外光谱或分子转动光谱；,(一) 分子吸收光谱,(二) 紫外可见吸收光谱的产生,预 备 知 识,有机化合物的紫外可见吸收光谱是三种电子跃迁的结果：电子、电子、n电子。,n ,(二) 紫外

4、可见吸收光谱的产生,*n*n*,(二) 紫外可见吸收光谱的产生,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,1. 吸收光谱,也称为吸收曲线。用连续的光照射化合物的稀溶液，部分波长的光被吸收，被吸收光的波长和吸收程度取决于有机物的结构。以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标，即得吸收光谱。,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语, 同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max, 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,KMnO4 的吸收曲线,(

5、三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱 (Absorption spectra of Cr2O72-、MnO4- ),(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语, 吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在max处吸光度A 的差异最大。此特性可作作为物质定量分析的依据。,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,2. 发色团和助色团,发色团也称为生色团。分子中的某一基团能在一定的波段范围内产生吸收而出现吸收带，这一基团称为生色团。典型的生色团有羰基、羧基、酯基、偶氮基、硝基以及芳环等。这些生色团的

6、结构特征是都含有电子。,有一些含有n电子的基团(如OH、OR、 NH、NHR、X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收200nm的光)，但当它们与发色团相连时，就会发生n共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,3. 蓝移和红移,由于取代基的作用或溶剂效应，导致发色团的吸收峰向长波方向移动的现象称为向红移动，简称红移。发色团的吸收峰向短波方向移动的现象称为向紫移动，简称蓝移。,由于化合物的结构改变或其它效应,使吸收强度增加的效应称为浓色效应；使吸收强度减弱的效应称为淡色

7、效应。,(三) 紫外可见吸收光谱的常用术语,4. 浓色效应和淡色效应,(四) 吸 收 带,1. R带 从德文Radikal(基团)得名,为n*跃迁引起的吸收带。如羰基CO, NO2、 CHO等， 其特点为吸收强度弱，100，吸收峰波长一般在270nm以上；,2. K带 从德文Konjugation(共轭作用)得名,为*跃迁引起的，如共轭双键。该吸收带的特点为吸收峰很强，104，最大吸收峰位置一般在217280nm。共轭双键增加，max向长波方向移动，max也随之增加；,(四) 吸 收 带,3. B带 从德文Benzenoid(苯的)得名,为芳香化合物(包括杂环芳香化合物)的特征吸收带。这是由于

8、*跃迁和苯环的振动重叠引起的。苯蒸气在230270nm处出现精细结构的吸收光谱，称为笨的多重吸收带或精细结构吸收带。在极性溶剂中或苯环上有取代基时，复杂的B吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰，中心在256nm，220。,是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的跃迁所产生的。分为E1和E2吸收带，其中E1在185nm 附近，=47000，E2在204nm，=7900，均为强吸收。,(四) 吸 收 带,4. E带,(四) 吸 收 带,若苯环上有助色团：如OH、Cl等取代时,由于n共轭，使E2吸收带向长波方向移动,但一般在210nm作用；若有发色团取代且与苯环共轭(共轭)，则E2吸收带与K带合并并且

9、发生红移。,羰基双键与苯环共扼： K带强；苯的E2带与K带合并，红移； 取代基使B带简化； 氧上的孤对电子： R带，跃迁禁阻，弱；,(四) 吸 收 带,二、LambertBeer定律,朗伯(Lambert)和比耳(beer)分别于1760年和1852年研究了光的吸收与有色溶液液层的厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析法的理论基础。,LambertBeer定律的数学表达式。,二、LambertBeer定律,二、LambertBeer定律,吸光度与透光率之间的关系为：,三、吸光系数,(二) 吸光系数的表示方法,1. 摩尔吸光系数,它表示吸光质点的浓度为1mol/L，溶液的厚度为1cm时溶液

10、对光的吸收能力。值越大，表示吸光质点对某波长的光吸收能力越强，测定的灵敏度就越高。,单位为Lmol1cm1。,104，为强吸收，是灵敏的。,(二) 吸光系数的表示方法,2. 百分吸光系数,百分吸光系数溶液的浓度为1%(即1g/100mL)，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。,3. 换 算,第二节 光度法的误差及显色反应,一、偏离LambertBeer定律的因素,(一) 化 学 因 素,2,2,橙 色,黄 色,是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。 杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成,(二) 物 理 因 素,1. 非单色光的影响,2. 非平行光,3. 杂散光,二

11、、光度法测量误差及测量条件的选择,(一) 仪器测量误差,(一) 仪器测量误差,(一) 仪器测量误差,将此式对T微分：,两边同除以A，得：,将上式求导：,(一) 仪器测量误差,T=0.368,(一) 仪器测量误差,(二) 测量条件的选择,1. 测定波长的选择 吸收最大，干扰最小 2. 溶液吸光度的范围 0.20.7之间,三、显色反应及显色条件的选择,(一) 显色反应和显色剂,1. 在可见分光光度法中，将试样组分转变成有色化合物的化学反应称为显色反应。与被测组分化合生成有色物质的试剂称为显色剂。,(一) 显色反应和显色剂,2. 显色反应的条件：,(1) 选择性要好； (2) 灵敏度要高 (3) 有

12、色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定。 (4) 一般要求有色化合物的最大吸收波长与显色剂的最大吸收波长之差在60nm以上： (5) 显色反应的条件要易于控制。,(二) 显色条件的选择,1. 显色剂的用量,(二) 显色条件的选择,2. 溶液酸度,(二) 显色条件的选择,3. 显色温度及显色时间,四、参比溶液的选择,参比溶液是用于调节仪器工作零点的，若选择不适当，对测量读数的影响较大。,1. 溶剂空白 当试液、试剂、显色剂均无色时，用蒸馏水作参比液；,2. 试剂空白 如果显色剂或其他试剂略有吸收，可用不含待测组分的试剂溶液作参比溶液。,四、参比溶液的选择,3. 试样空白 如果试样中的其他组分也有吸

13、收， 但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液；当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂，将待测组分掩蔽后，再加入显色剂，以此溶液作参比溶液。,第三节 紫外可见分光光度计,一、基 本 组 成 (general process),光 源,分光系统,样品室,检测系统,信号显示系统,在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,一、基 本 组 成 (general process),(一) 光 源,可见光区：钨灯或卤钨灯作为光源，其辐射波长范围在3602500 nm。,紫 外 区： 氢、氘灯。波长范围185400 nm的连续光

14、谱。,(一) 光 源,氘灯紫外,卤钨灯-可见,(二) 分 光 系 统,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。,入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准 直 镜：使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； 聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝。,(二) 分 光 系 统,(二) 分 光 系 统,棱 镜,(二) 分 光 系 统,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,(二) 分 光 系 统,(三) 吸收池(比色皿

15、),样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。,要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）,(三) 吸收池(比色皿),(四) 检测系统,利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管、光电倍增管或光二极管阵列。,(五) 信号显示系统,检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,721型可见分光光度计,二、分光光度计的类型,紫外-可见分光光度计,第四节 紫外可见吸收光谱与分子结构的关系,一、有机化合物的紫外吸收光谱,(一) 饱和烃,只能产生*跃迁,当饱和单键碳氢化合物中的氢原子被氧、氮、卤素、硫等杂原子取代时，产生n*跃迁、吸收峰向长波方向移动。,通过共轭作用，形成大键，吸收峰向长波方向移动(红移)，吸收强度也明显增加。,2. 共轭烯烃,(二) 不饱和化合物,1. 不饱和烃,共轭双键越多，红移越大，甚至产生颜色。,(二) 不饱和化合物,醛和酮均含有羰基，存在n、三种电子，能实现n*跃迁(270300nm附近，为1020)，n*跃迁(180nm左右)和*跃迁(150nm左右)。,3. 醛和酮,(二) 不饱和化合物,不饱和醛酮：,乙烯基*跃迁吸收带红移至220260nm，=104左右；羰基R带红移至310330nm， 102,