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1、原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）,取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养：加入0.25胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管
2、），静止，吸去上清，加入510ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养,细胞培养中应注意的几个问题,1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。 2）PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0。 3）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。,4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2-0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。 5）去除死细胞 6）温度控制：动物细胞培养对温
3、度波动的敏感性很大。温度低于36.5，细胞生长缓慢；温度高于37.5，细胞存活力降低。,细胞培养中应注意的几个问题,细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,传代细胞培养操作,将长成单层的细
4、胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液(以液面盖住细胞为宜)，静置510分钟 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入35ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液 将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养,细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的
5、。然后按下式计算： 细胞数/ml4大格细胞总数/ 410000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,2台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力； 方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到
6、染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。,MTT比色法操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。,慢冻程序,标准程序：当温度在-25以上时， 12/min当温度达-25以下时， 510/min当温度达-1
7、00时，可迅速放入液氮中 简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,细胞冻存方法,1预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； 2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)； 3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）
8、5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,实验准备,实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，培养板， 冻存管,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面
9、消毒,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不能残留任何物质,浸泡 初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上,浸酸： 玻璃器皿浸泡到清洁液中 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质
10、浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 配制洗液时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置 如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用,胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法 每次用后立即
11、置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用,完全培养基的组成,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位毫升,称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断
12、搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,EDTA2Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存,pH 调整液,NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存 HEPES（分子量238.31）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L,
