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1、发酵工程概述,基本概念,人们将利用微生物的生命活动，以获得微生物菌体或其代谢、转化产物的过程统称为发酵。 发酵工程是现代生物技术的重要组成部分之一，是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合，利用微生物的代谢、转化功能，获得有用物质的工程技术。,发酵工程简介,发酵技术有着悠久的历史 作为现代科学概念的微生物发酵工业，就是在20世纪40年代随着抗生素工业的兴起而迅速发展起来的 现代发酵技术是在传统发酵技术的基础上，结合了现代DNA重组，细胞融合、分子修饰改造等新技术。 近年来，由于代谢调控技术，连续发酵技术、高密度培养技术、发酵与产物分离的偶联技术、在线监测技术和发酵过程的计算机自
2、动控制技术等的迅速发展，以及发酵设备、工艺研究的进步，发酵工业发展到了一个新的高度,发酵工程的特点,反应条件温和，设备简单，工业上通常采用通气搅拌罐反应器，可以用相同或相似的设备生产不同的发酵产品，使一种设备具有多种用途 微生物生长繁殖迅速，发酵生产周期相对较短，且不受气候、季节等自然条件的影响 发酵原料来源广泛，价格低廉 发酵反应以微生物的自动调控方式进行,通过发酵能够容易地生产复杂的高分子化合物，按照生物体特有的反应机制，能高度选择性地进行复杂化合物特定部位的氧化、还原、官能团导入等反应 通过诱变育种、基因重组、细胞融合和蛋白质工程等手段对微生物菌种进行改良，可以在不增加生产成本的前提下大
3、幅度提高生产效率 利用现代分子生物学手段，向微生物细胞中中引入外源基因，可以大量生产动植物细胞中才有的微量生物活性物质如胰岛素、水蛭素等,发酵过程中应注意的问题,发酵原料大多是农副产品，不同批次、产地的原料的化学成分和组成变动较大，对发酵有一定影响。 由于微生物中含有多种酶，发酵过程中副产物的产生不可避免，会对产物的分离纯化带来不利影响 发酵产物的获得除了受环境的影响外，还受细胞内因素的影响，特别是以中间代谢物为目的产物时，如果不能适当控制发酵条件，由于微生物代谢情况的变化，将导致产品数量和质量的下降,微生物容易发生遗传变异，菌种会在生产中失去其优良性状，降低甚至丧失生产能力，难以实现连续操作
4、 发酵生产需要在无菌的条件下进行，整个发酵过程必须在无菌条件下进行，一旦失败，就会遭受重大损失。特别是噬菌体对发酵的危害更大 发酵废水常具有较高的COD和BOD，需要进行处理,目前已知具有生产价值的微生物发酵类型,微生物菌体发酵 微生物酶发酵 微生物代谢产物发酵 微生物转化发酵 生物工程的细胞发酵,发酵工业中常用的微生物,微生物,微生物一词并非生物分类学上的专门名词，而是对所有形体微小，单细胞的或个体结构比较简单的多细胞的或没有细胞结构的低等生物的统称。自然界中微生物的种类繁多，它们有着不同的形态结构和生理特征，可以分为不同的类群。广义的微生物包括病毒、原生动物、细菌、放线菌、霉菌、单细胞藻类
5、、支原体等，其中细菌、放线菌、酵母和霉菌等广泛地应用于发酵工业。,细菌,大肠杆菌（Escherihia coli） 醋酸杆菌（Acetobacter） 乳酸杆菌（Lactobacillus） 丙酮丁醇梭菌（Clos.acetobutyleum） 肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）,放线菌,放线菌因其在培养基的表面上的菌落呈放射状而得名。放线菌在自然界分布广泛，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较多。大部分是腐生菌，少数寄生。放线菌有发育良好的菌丝体，菌丝无横隔，为单细胞原核生物。 放线菌最大的经济价值是能产生多种抗生素，如链霉素、土霉素、金霉素、争光霉素、卡那霉
6、素等，据统计，从自然界中发现和分离了五千多种抗生素，其中有四千多种来自于放线菌。,放线菌,链霉菌属（Streptomyces） 小单孢菌属（Micromonospora） 若卡氏菌属（Norcardia 游动放线菌属（Actinoplanes）,霉 菌,霉菌是指在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌，亦称为丝状真菌。霉菌的菌落特征与放线菌接近，但霉菌的菌落形态较大，一般质地比放线菌疏松，外观干燥不透明。 霉菌在自然界分布广泛，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。霉菌喜偏酸性环境，大多数为好氧性微生物，多腐生，少数寄生。,工业上常用的霉菌,青霉属（Penicillium） 根霉属（R
7、hizopus） 曲霉属（Aspergillus） 红曲属（Monascus）,酵母（Yeast）,酵母属（Saccharomyces） 假丝酵母属（Candida） 红酵母属（Rhodotorula）,培养基,培养基的分类,根据培养基营养物质组成的化学成分是否已知，可将培养基分为合成培养基、半合成培养基和天然培养基。 根据培养基制成以后的物理形态，有可将培养基分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。 根据培养基的用途，可将培养基分为增殖、选择、鉴别培养基。 在发酵工业的生产中，人们还常常依据培养基在发酵生产中的用途，将其分为孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。,培养基的组成,碳源： 是指微
8、生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。碳源通常也是有机体生长的能源物质。微生物所能利用的碳源物质非常广泛，从简单的无机含碳化合物二氧化碳、碳酸盐到复杂的天然有机含碳化合物都能被微生物所利用。 目前发酵工业中常用的碳源物质有各种淀粉（玉米、马铃薯、小麦、燕麦 ）、饴糖、糖蜜、某些有机酸和一些石油产品。,氮源 是指被微生物用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养物质。这类物质主要是用来合成细胞物质中含氮物质的原料，一般不能作为能源物质。 发酵工业中常用的氮源包括有机氮和无机氮两大类，黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、蚕蛹粉、鱼粉等都是常用的有机氮源，常用的无机氮源有氨水、
9、碳酸氨、硫酸铵、硝酸盐、尿素等,无机盐和微量元素,无机盐是微生物生长所必不可少的营养物质，为有机体生长提供各种金属元素。微生物生长所需要的无机盐有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁、猛等金属元素的化合物。 金属元素的生理功能包括构成微生物自身组成物质（如磷、硫）、作为酶及辅酶的组成成分或维持酶的活性（镁、铁、锌、钴、锰等）、维持细胞结构的稳定性、调节与维持细胞的渗透压平衡等。,生长因子,生长因子是指微生物生长繁殖所必需而自身又不能合成的某些微量有机化合物。包括维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基的衍生物以及某些脂肪酸等。 酵母粉、蛋白胨、牛肉膏和一些动植物组织的浸液，如动物的心、肝、马铃薯
10、、番茄、豆芽等的浸液，都是生长因子的丰富来源。,水,水是培养基的主要组成部分，也是微生物的重要组成成分，占生活细胞总量的90%。 水是许多化学物质的良好溶剂，有机体的营养物质的吸收和各种代谢反应都是在水中进行的，水还直接参与许多的代谢反应。同时水的比热高，是热的良好导体，能有效地控制细胞内的温度变化。 发酵生产中常用的水有自来水、深井水和地表水。,代谢产物的前体、诱导物和促进剂,所谓前提物质是指被微生物直接用于产物的合成的化合物，如青霉素发酵合成时添加的苯乙酸，可大大提高青霉素G的产量。微生物发酵过程中，适当的诱导物可以诱导某些酶的产生，从而提高发酵目的产物的产量，如向麦角碱产生菌的发酵液中添
11、加色氨酸，可诱导麦角碱生物合成的二甲基烯丙基色氨酸合成酶的合成作用，增加该酶的活力 目前，对发酵过程中诱导物、促进剂以及前体物质的添加，还没有明确的规律可循，很多是在对发酵菌株的生理生化研究基础上，根据生产经验和实验结果确定的。,培养基的配制原则,根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基 营养成分的适当配比 pH值 其它 ：如培养基的渗透压、培养基的氧化还原电位等方面因素的影响。,培养基的灭菌,灭菌：是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。 培养基灭菌最基本的要求是杀死培养基中的所有微生物，再接入纯的菌种以达到纯种培养的目的。,常用消毒和灭菌方法,菌种的分离及优良菌种
12、的选育,微生物的分布,自然界中的微生物资源十分丰富，是自然界中分布最广的一群生物。在土壤、空气、江河湖海、动、植物的体内、体表都生活着大量的微生物，微生物的种类之多，至今仍无法估计。 土壤中具有微生物生长繁殖所需要的一切营养物质和进行生命活动的一切条件，有“微生物天然培养基”的称号。 在水体和空气中也有着相当数量的微生物分布，但不论是种类还是数量都比土壤中的少 在一些极端的环境（如高温、高压、高盐）中，也分布着相当数量的微生物，它们往往具有特殊的基因、特殊的机能，也是重要的菌种来源,菌种的分离,采样 ：应根据菌种分离的目的，结合微生物的分布、特性以及生态环境综合考虑，设计采样方案。 富集与分离
13、 ：在多数情况下，采集样品中目的微生物的数量有限，一般应进行富集培养后再进行分离纯化，通常称为施加选择压力的分离方法。,用于细菌分离选择培养基中的抑菌物,用于放线菌选择分离的抑菌物质,优良菌种的选育,优良生产菌株应具有的特性,能在尽可能短的发酵过程中生产大量的发酵产品 ，菌株应生长旺盛，缩短发酵周期 发酵过程中应产生较少的泡沫以提高发酵设备的利用率 生产菌株的生产能力对发酵原料的波动的敏感性要小，对发酵过程中添加的前提物质的耐受性要好 生产菌株对噬菌体应有一定的抗感染性，具有为定的遗传特性,自然选育,微生物在传代和发酵过程中，也会以一定的频率发生自发突变，自然选育是指不经过人工处理，利用微生物
14、的自发突变进行菌种选育的过程 微生物的这种自发突变发生的频率很低，据统计大约为10-8-10-9，其中正向突变的比率就更小，与诱变育种、杂交育种和基因工程育种相比，一般需要坚持相当长的时间才能奏效。,诱变育种,诱变育种是指利用物理或化学的诱变剂处理微生物细胞群，使微生物的遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、倒位、易位等突变，或使DNA的某一部位发生点突变，从而引起微生物的遗传变异，改变微生物的遗传性状的过程。诱变育种在发酵生产中具有极其重要的意义，目前工业发酵的高产菌种，几乎都是经过诱变育种而大大提高了生产性能的,诱变育种的一般过程,出发菌株的选择,出发菌株就是用于菌种选育的原始菌株 出发菌
15、株最好是经过生产中选育过的自然变异菌株，应具有生长迅速、营养要求低、产生孢子多等有利性状 由于某些菌株在发生某一变异后，会提高其他诱变因素的敏感性，可考虑作为出发菌株。,诱变剂及诱变处理,诱变剂主要有物理诱变剂和化学诱变剂两大类。物理诱变剂如紫外线、X射线及其他放射线等；化学诱变剂的种类很多，如烷化剂、碱基类似物等。 在诱变育种中，选用诱变剂的最适剂量是至关重要的 在诱变处理的方法有单一诱变剂处理和复合处理，诱变剂的复合处理常常呈现出一定的协同效应,诱变菌株的筛选,菌种的筛选方法一般分为初筛和复筛两个阶段。 初筛既可在培养皿平板上进行，也可在摇瓶中进行。在平板上进行快速简便，工作量较小且结果直
16、观，但其缺点是培养条件与发酵培养差别很大 复筛是对经过初筛的突变菌株的生产性能进行比较精确的测定工作 经过诱变、初筛、和复筛所获得的高产菌株，一般仍不能立即用于发酵生产，还要对这些选育出的菌株进行生产性能的测试和发酵条件、营养条件的优化研究，符合发酵菌种特点的高产菌株才能用于发酵生产,营养缺陷型 菌株,是指通过诱变产生的在一些营养物质，如氨基酸、维生素、碱基等的合成能力上出现缺陷，必需在培养基中加入相应的有机营养成分才能正常生长的菌株。 营养缺陷型菌株由于具有明显的遗传标记，在理论的研究和生产实践中都具有十分重要的意义,营养缺陷型菌株的诱变选育,发酵的过程及发酵的操作方式,微生物发酵的一般过程,发酵菌种,进行发酵生产的菌种必须是经过选育的具有优良生产性状的菌株或是经过基因工程改造的“工程菌” 在发酵生产中，要对生产菌种不断地进行选育和菌种的复壮工作，以防止其优良性状的丧失。不断提高生产菌株的生产性能。 生产菌种的衰退，与菌种的传代次、保藏方法和培养条件等密切相关,常用菌种保藏方法的比较,
