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1、,琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制,实验目的:,学习动物的处死与组织匀浆的方法。学习离心机的使用方法。理解酶的竞争抑制原理。,2018/10/17,背景介绍,琥珀酸脱氢酶是位于动物细胞线粒体内膜上的一种氧化酶，它直接与电子传递链相连，是呼吸链的标志酶，亦即线粒体或细胞内三羧酸循环的一种标志酶。 在体内，该酶可使琥珀酸脱下的氢进入FADH2呼吸链，通过一系列传递体最后传递给氧而生成水。当在缺氧的条件下可用甲烯蓝(蓝色)作为受氢体时,甲烯蓝被氢还原成甲烯白(无色),其反应如下：,甲烯蓝，又名亚甲蓝，美蓝,实验原理:,竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争
2、性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色）作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。,竞争性抑制的机理, 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物； 抑制剂与酶的结合部位（活性中心）与底物与酶的结合部位相同； 抑制剂浓度越大，则抑
3、制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小； 动力学参数：Km值增大，Vm值不变。抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例注意：结合在酶的同一部位以及结构类似并不是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位阻碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以造成竞争性抑制。,离心技术:,离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。 离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的
4、密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。,离心力和相对离心力,溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力，其定义为： F = m2r 式中： F 为离心力的强度； m 为沉降颗粒的有效质量； 为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s； r 为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。 很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。离心力通常以相对离心力Fcf 表示，即离心力F 的大小相对于地球引力(G)的多少倍，单位为g，其计算公式如下： Fcf = 1.119105(h)2rg 可以看出，在同一转速下，由于f 的不同，Fcf相差会很大，实际应用时
5、一般取平均值。在离心实验的报告中，Fcf、r 平均、离心时间t 和液相介质等条件都应表示出来，因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。显然Fcf是一个只与离心机相关的参数，而与样品并无直接的关系。,离心方法分类:,1.差速离心法:通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。 2.密度梯度离心法： 1）速度区带离心法 2）预制梯度等密度离心法 3）自成梯度等密度离心法 3.沉降平衡离心法:根据被分离物质的浮力密度差别进行分离，所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。,离心工
6、具:,离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。 离心机的种类很多，按照使用目的，可两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。 通常所使用的离心机根据转子转速大小的不同可分为低速离心机、高速离心机和超速离心机三类。,超速离心机,高速离心机,低速离心机,实验器材与试剂:,（一）器材 小白鼠，研钵，
7、手术剪，手术镊子，移液管，可调式移液器，10ml离心管，低速离心机 （二）试剂 1. pH=7.4的磷酸缓冲液 2. 0.25%琥珀酸钠溶液 3. 0.5%草酸钠溶液 4. 0.01%甲烯蓝溶液 5. 0.9生理盐水,实验操作:,1.肝糜液的制备:取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死。剖腹将肝脏全部取出，置于研钵中，用生理盐水洗净肝脏中的血液。用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入少量磷酸缓冲液，边加边磨，共加入7ml。搅匀后倒入圆底离心管中，离心约3min(3000r/min)。将上清液倒入一支试管中备用，此即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液。 2.另取中试管5支，标号，按下表操作。,表5-5 琥珀
8、酸脱氢酶活力的测定,注：甲烯蓝的量可以根据肝糜液制备情况进行调整,摇匀，静置于37的水浴中(此后再勿摇动)，注意观察各管的颜色变化。记录各管颜色消退的顺序和时间，并分析原因。 震荡褪色的反应液，观察实验现象并分析产生该现象的原因。,注意事项:,1.本实验成败的关键是肝糜液的制备的质量。 肝脏一定要充分研磨至糊状，以使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里。 2.离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的离心管对称放置 3.离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊,思考题:,1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能再摇动? 2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本实验成功的关键是什么？ 3：抑制剂还可以选用什么物质？ 4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点？ 5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺陷与改进方案？,PPT模板下载： 行业PPT模板： 节日PPT模板： PPT素材下载： PPT背景图片： PPT图表下载： 优秀PPT下载： PPT教程： Word教程： Excel教程： 资料下载： PPT课件下载： 范文下载： 试卷下载： 教案下载：
