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1、荧光定量PCR实验原理及数据分析,Marketing Dep. Icy Wu,内容概要,荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南,2,,荧光定量PCR原理定义,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析 与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,,3,荧光定量PCR原理常用名词概念,扩增曲线 荧光阈值 Ct值,,4,4,,荧光定量PCR原
2、理扩增曲线,,5,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,5,,荧光定量PCR原理荧光阈值,,6,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值,Threshold,6,,荧光定量PCR原理Ct值,,7,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产
3、物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Ct value,7,,荧光定量PCR原理Ct值的重现性,,8,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性,8,,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,,9,理想的PCR反应,XnX0 2n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,9,,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,,10,非理想的PCR反应,XnX0 （1En）n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,En：扩增效率,10,,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,,11,在
4、扩增产物达到荧光阈值时,XCtX0 * （1En）CtM （1）,整理方程式（2）：,方程式（1）两边同取对数得：,XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M,Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2）,Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1En）,11,,荧光定量PCR原理Ct值与起始模板量的关系,,12,Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Lg of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,12,,荧光定
5、量PCR原理荧光定量反应性的确认,,13,线性关系、扩增效率确认 相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3 -3.5 PCR扩增效率（E）：0.9-1.2 检测灵敏度确认 35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增 No template control确认 35 Cycles内无引物二聚体产生,13,,内容概要,荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南,14,,14,,常用荧光定量标记方法,,15,非特异性荧光标记 SYBR Green I特
6、异性荧光标记 TaqMan Probe,15,,SYBR Green I 染料法原理,,16,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,16,,SYBR Green I 染料法作用机理,,17,热变性,引物退火,延伸反应,17,,SYBR Green I 染料法问题点与关键点,,18,问题点： SYBR Green I 与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！,18,,SYBR Green
7、 I 染料法融解曲线,,19,将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT),原始图谱,对数图谱,19,,SYBR Green I 染料法融解曲线,,20,融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光： 定量准确,融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光： 定量不准确,20,,SYBR Green I 染料法优缺点,,21,使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优势,优 点,无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低,缺 点,21,,Taqman 探针法原理,,22,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher
8、, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,22,,Taqman 探针法工作机理,,23,热变性,引物和探针与模板退火,延伸反应,探针,报告基团,淬灭基团,探针,DNA聚合酶,引物,R,R,R,R,23,,Taqman 探针法PCR体系的建立,引物、探针的设计： 探针Tm为68-70, 30 bp, 5不能有G, G可能会淬灭荧光素 引物尽量靠近探针, 扩增片段400 bp, 引物Tm为59-60 反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S60，30-60S （Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通
9、过温度梯度优化退火温度 优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 其他与常规PCR相同,,24,24,,Taqman 探针法优缺点,,25,高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针,缺 点,25,,实时荧光定量PCR分类分子信标,,26,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,环,茎,荧光素 淬灭剂,26,,实时荧光定量PCR分类分子信标,,27,27,,实时荧光定量PCR分类分子信标,,28,高特异性：对目标序列 检测S
10、NP最灵敏的试剂之一 荧光背景低,优 点,只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高,缺 点,28,,几种荧光定量PCR方法的应用比较,,29,29,,荧光定量PCR技术的主要应用,定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等,,30,30,,内容概要,荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南,31,,31,,荧光定量PCR的解析方法,绝对定量解析方法相对定量解析
11、方法,32,,32,,绝对定量的定义,,33,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,33,,绝对定量分析几要素,,34,一个目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择 SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。 实验结果显示 扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。,34,,绝对定量质粒
12、标准品的制备,,35,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,目的基因,基因组DNA,质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用,35,,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,,36,倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）=OD26040稀释倍数 样本分子量=碱基数324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,36,,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,,37,方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。,37,,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,,38,38,,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,
