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1、无菌检验方法验证,梁毅 中国药科大学,Contents,无菌检验方法,定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品，医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。条件无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。,无菌检验方法验证,方法验证试验当建立产品的无菌检查方法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的祖坟或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证
2、。证明在试验条件下没有抑菌作用。如：防腐剂，抗生素,无菌检验方法验证,无菌检验方法 验证的意义,1.符合国家药典标准，与先进国家的药典和药品 技术审评接轨 2.是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循 工作的基础。 3.通过验证试验，可对每种药品的具体检验方法 的可靠性和结果的准确性予以确认，从而形成标 准化的操作。 4.通过对同品种，但不同批号或不同生产厂家的 产品的微生物学验证试验比较，可以发现产品所用 原料质量或工艺流程中是否存在污染抑菌物质的 问题，具有药品质量控制的意义。,无菌检验方法验证,开展验证的思路和程序,首先了解供试品是否具有抑菌性，抑什么菌,考虑和选择出适当的方法已消除或减
3、低供试品的抑菌性,用实验证明你所用的方法已消除抑菌性能使人工加入的各种菌生长良好。,将所作实验记录在案即为确认该供试品在该检验量，在该检验条件下已充分消除抑菌性，能确保实验结果正确可靠的验证试验结果报告,无菌检验方法验证,验证的重点环节,无菌检验法验证,验证报告的重点,验证制成适宜供试液的前处理方法，证明方法对微生物生长、检出无影响。,验证样品有无抑菌性、抑什么菌？最敏感的菌是那一个？ 其结果将直接影响下续检验方法的选择和操作步骤的进行，并是最终所选检验方法和操作步骤合理性的证明。,验证消除样品抑菌活性的方法，证明方法的有效性及方法对污染菌生长无影响。如何选择合理、适宜、简单有效的消除抑菌活性
4、的方法是当前验证工作的关键。,无菌检验方法验证,按药典对样品无菌检查的规定和要求，或是微生物限度检查的规定和要求进行，对每一试验菌应逐一进行验证试验。 按药典对样品无菌检查的规定和要求，或是微生物限度检查的规定和要求进行，对每一试验菌应逐一进行验证试验。微生物学的验证试验一般分 4个步骤进行：,无菌检验方法验证,1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用菌液制备的方法将规定需用的试验菌分别制成每毫升中含10100个菌（CFU）的供试菌液。验证报告中应给出各种试验用菌液的制备和菌液含菌量计数的原始记录。,无菌检验方法验证,2、样品的前处理方法 为达到制备成均匀的供试液及
5、为后续采取消除抑菌活性的方法作准备，将所采取的前处理方法应用和参加到验证试验中，以证明所用处理方法对各试验菌的生长无影响。 按供试品的性状选用以下适宜的方法，或几种方法联合使用：,无菌检验方法验证,溶解： 验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微生物生长无影响。 乳化： 验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、使用量及对微生物生长无影响。 破乳： 验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生物生长无影响。 萃取： 验证有机相选择的合理性、有效性及对微生物生长无影响 稀释： 验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍数。 离心： 验证所用转速、时间和微生物的分布情况。,3、确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌方法
6、一： 可通过查阅临床药物实验手册、文献资料（特别是杂志“Drug”，每一种新药上市，都有专门的综述）、申报资料中的药效学资料，关注其对不同细菌的MIC情况、参考已经验证过的品种、抗菌药物可根据抗菌谱确定其敏感菌、中成药如果抗菌谱不清楚，至少需选择一株细菌和一株真菌来试验等方法。也可直接通过验证实验确定之。,方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10100个，如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验之。将这些试验记录在案就是证明该供试品无抑菌性的验证试验部分；如加
7、入的微生物不生长或生长缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢，这一种菌就是该样品的敏感菌。,4、选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌活性根据供试品特性选择药典规定的消除供试品抑菌活性的方法（一种或几种联合），或利用药物化学知识，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效的中和剂（这是值得鼓励的发展方向）。并通过模拟实验（验证试验）对消除或降低抑菌活性的效果加以检验。,无菌检查方法验证中可采用的方法：1.薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体供试品（只要性状许可，应首先采用）。验证和对验证结果技术评
8、价的重点是：确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用量。2.直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管。取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色链球菌、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另一管作为对照，置规定的温度培养35天。,验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓慢或不生长，说明供
9、试品仍有抑菌活性，应考虑进一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性，并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低抑菌活性。,无菌检验方法验证报告,一份标准的技术性验证报告应由以下部分组成： 一、实验目的 二、样品信息 三、验证方案（初步验证方案、重新验证方案，纠正原因）和方案的批准。 四、仪器与实验材料(培养基、菌种、仪器、设备) 五、方法验证(方法依据、供试菌液制备、菌液计数、敏感菌选择、所用方法考察、方法验证步骤、实验原始记录)。 六、验证结论。 七、【检查】项下【无菌】或【微生物限度】具体方法确定。 八、实验员签名、验证报告批准人签名。,无菌检验阳性结果调查,无菌检查试验所用的设备及环
10、境的微生物监控结果不符合无菌检查法要求 回顾无菌测试过程，发现有可能引起微生物污染的因素阴性对照有菌生长 供试品中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的,无菌检验阳性结果调查,实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的,无菌检验阳性结果调查,若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染原因和污染源 人 物料 环境 设备 方法和工艺 所有无菌检验失败和产品不合格数据应保留记录并归纳在一个分类表中，进行定期回顾和分析 偏差处置和定期生产回顾,无菌检验阳性结果调查,为便于调查而要求的文件 所有与检验相关的可追溯性文件都必须保留 灭菌柜灭菌参数记录 培养基、设备准备使用记录 培养基灵敏度测试记录 培养箱温度记录 设备物料记录无菌室的记录 设备校验维护记录 隔离系统灭菌记录 清洁记录 测试数据 环境监控记录 趋势分析 无菌检验失败调查记录,无菌检验阳性结果调查,结论: 在根本原因找出前，千万不能随意丢弃无菌检验结果 注意：没有记录就表示没有做 所有无菌检验结果和调查数据应保存并规类进行趋势分行,
