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1、生命科学发展回顾与基因沉默,生命科学的发展,生物学“(Biology)在1802 年 ,由法国生物学家 J.B.de 拉马克和德国博物学家 G.特雷维拉努斯分别最先采用. 生物学经历了三个发展阶段： 描述生物学阶段 （19世纪中叶以前）(经典生物学) 实验生物学阶段（19世纪中到20世纪中)(分子生物学) 创造生物学阶段 （20世纪中叶以后）(现代生命科学),描述生物学阶段 （19世纪中叶以前）,主要从外部形态特征观察、描述、记载各种类型生物，寻找他们之间的异同和进化脉络。1735 年 瑞典植物学家( Linne C.V林奈)所著的巨著自然系统首创物种二名法; 1827 年 俄国胚胎学家 .贝
2、尔发表论哺乳动物卵的起源,首次准确地描述了哺乳动物的卵形态.1837 年又出版了动物胚胎学专著.这是最早的比较胚胎学著作,18381839 年 德国植物学家 Schleidn,M.J.(M.J.施莱登)和德国动物学家 Schwann,T.A.H.(T.A.H.施旺)通过先后 分别发表植物发生论,动植物结构和生长一致性的显微研究等论著共同建立了细胞学说. 1859 年英国生物学家 Darwin,C.R.(C.R.达尔文)发表了物种起源,第一次用大量事实和系统的理论论证 了生物进化的普遍规律,提出了自然选择学说,1865 年 瑞士生理化学家 Miescher J.F.(J.F.米舍尔)首次发现并分
3、离出核素,即核酸.奥地利修道士 Mendel G.J.(Mendel Gregor Johann,G.J.孟德尔) 发表了他的植物杂交的试验论文, 通过豌豆杂交试验所发现的两个遗传学定律,即分离定律与自由组合定律,也 被称为“孟德尔定律”,提出了遗传因子学说,开创了遗传学研究.,1910 年 美国遗传学家 Morgan T.H.(T.H.摩尔根),通过果蝇的研究,发现伴性遗传现象,即连锁定律和基因交换现象 ,第一次用实验证明“基因” 定位在染色体上.出版了孟德尔遗传原理,补充发展了孟德尔定律,提出了现代遗传学的基因学说.,实验生物学阶段（19世纪中到20世纪中),利用各种仪器工具，通过实验过程
4、，探索生命活动的内在规律,1924 年 德国细胞学家福尔根发现了核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA). Fenlgen R.和 Rossenbeck H.发明了特异性 DNA 染色法,即 Feulgen 染色法. 1927 年 美国遗传学家 Muller H.J.(H.J.缪勒)发现,X 射线照射可以诱使遗传基因发生突变.,1933 年 美国遗传学家 Painter T.S.(T.S.佩因特)研究发现了果蝇唾腺细胞的巨大染色体,为制作详细的染色体图提供了可行的实验材料. 1941 年美国生化遗传学家 Beadle George W.(G.W.比德尔)和生化学家 Tatum Edward
5、L.(E.L.塔特姆)合作, 提出“一个基因一个酶“ 这一假说,1944 年美国女遗传学家 B.麦克林托克在提出 “可移动基因学说“,认为基因在染色体上的位置不是完全固定的,可以变换移动,有助于说明动,植物 某些先天性特征从一个染色体转移到另一个染色体这一现象. 1950 年 奥地利出生的美国生化学家 Chargaff E.(E.查加夫)等人发现了任何细胞 DNA 分子中嘌呤和嘧啶之间的当量关系, 即碱基 A 和 T,以及 G 和 C 的比率是恒等的,为 1953 年 DNA 双螺旋结构的建立提供了理论依据,1952 年 美国遗传学家莱德伯格发现了通过噬菌体的“转导“所实现的不同细菌间的基因重
6、组现象. 1953 年 美国生物学家 Watson J.D.(James D. Watson,J.D.沃森),英国生物物理学家(晶体结构分析学家) Crick F.H.C.(Francis H. Crick,F.H.克里克)在英国女生物学家 Franklin R.(R.富兰克林)和英国生物学家(Wilkins M.H.F. 威尔金斯)等人所拍摄的清晰的 DNA 分子晶体 X-衍射照片的基础上,首先 提出了 DNA 双螺旋结构的分子模型,并推测了 DNA 复制机制.,沃森和克里克在讨论DNA双螺旋模型,沃森和克里克在,1956年美国生物化学家 E.W.萨瑟兰发现 cAMP.1958 年报道以后,
7、又历时 7 年,研究阐明了 cAMP 是多种激 素在细胞水平上起作用的“第二信使“. 俄国出生的美国天体物理学家 G.伽莫夫提出了三联体密码的假设, 即每种氨基酸都有一个由三个核苷酸组成的密码,并提出有 64 个密码的推论. (遗传密码建立),创造生物学阶段 （20世纪中叶以后）,分子生物学和基因工程的发展使人们有可能“创造”新的物种。 1959 年美籍华裔生殖生理学家张明宽在长期对生殖生理规律研究的基础上, 获得世界上第一个哺乳动物体外 受精成功的“试管兔子“,为 1978 年世界上第一个“试管婴儿“的诞生,奠定了科学基础.,1973 年Cohor S.R.,Chang A.C.Y.,Boy
8、er H.W.和 Holling R.B.首次在体外构建具有功能的细菌质粒. 美国分子生物学家 Stanley Cohen(科恩),美国生物化学家 Herbert Boyer(博耶)合作,完成了将两 种不同基因拼接的复合基因引入细菌的实验, 并申报了第一个基因重组技术专利. 将外源 DNA 片段插入大肠杆菌质粒后,生成了一个 嵌合质粒. 此嵌合质粒重新导入大肠杆菌时,仍具有功能.,染色体移植,2006科学杂志刊登报告说，英国科学家首次在实验室中成功培养出带有唐氏综合症的老鼠,2010美国研究人员克雷格文特尔在实验室里创造出世界首个人造生命细胞.用了“四瓶化学物质”为他们的“人造细胞”设计了染色
9、体，然后把这个基因信息植入另一个修改过的细菌细胞中，这个由合成基因组控制的细胞具有自行复制的能力。,人类基因组测序,2000年人类基因组计划首次破解人类基因密码，绘制出人类约3万个基因30亿个碱基图谱。2006成功绘制基因复制过程中出现不同突变的复制变异图，补充了先前得到的人类基因图谱,首个基因组研究所创办人克雷格.温特尔博士 2007年9月4日,RNA干扰,1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1(蛋白酶激活受体属于与G蛋白相偶联、有七个跨膜单位的受体家族, 有四个成员: PAR-1, PAR-2, PAR-3和PAR-4.)基因时，
10、发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径 .,1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默(Gene Silencing) 。 1999年发现RNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的生物中细胞。,基因沉默,两种水平上引起的基因沉默 1,真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际
11、上是形成异染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态. 基因沉寂导致相应区段内的遗传信息不能被转录。 2,转录后基因沉默(post-transcriptional gene silen-cing,PTGS)，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活。,基因沉默是基因表达调控的一种重要方式，是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制，在 外源DNA侵入、病毒侵染和DNA转座、重排中有普遍 性。意义: 1)揭示生物体基因遗传表达调控的本质，在基因克服基因沉默现象，从而使外源基因能更好的按照人们的需要进行有效表达； 2)利用基因沉默在基因治疗
12、中有效抑制有害基因的表达，达到治疗疾病的目的. 3)病虫草害防治中的应用,RNA干扰的研究与应用,RNAi,RNAi(RNA interference)即RNA 干扰1998年由Fire首次发现并命名为转录后水平的基因沉默 ，是美国Science和Nature评出的2002年度最重要的科技成果之一，正成为基因功能研究和基因治疗研究的热点 。,Protein synthesis,“小RNA掀起大风浪”,科学杂志 第298期，2002，12，20,内容,1.RNAi的作用机制 2.RNAi的特点 3.RNAi的应用 4.前景展望与存在问题,RNA干扰的机理,DNA质粒/U6shRNA,1. RNA
13、i的作用机制,RNAi的作用机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，形成22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达 。,RNAi作用机制模型,1.起始阶段,dsRNA（Double stranded RNA）进入细胞的方式可以是外源导入或者转基因、病毒感染等。引入的dsRNA被核酸RNase家族中特异识别dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约2123nt的由正反义链组成的双链小分子干
14、扰RNA(siRNA)，且每条单链的3 端都带有2个突出的非配对碱基(多数是UU)。siRNA又被称为引导RNA(guide RNA)，是识别靶RNA 的标志。siRNA 的生成启动了RNAi反应。,2效应阶段,siRNA结合一个核酶复合物，形成所谓的RNA诱导的沉默复合物(RNAinduce silencing complex，RISC)。这个核酶复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成。激活该复合物需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程，活化以后的RISC定位到与siRNA中的反义链互补的靶mRNA转录本上，并在距离siRNA3 端12个碱基的位置m
15、RNA。,2.RNAi的特点,2.1 siRNA的结构和功能之间存在相关性 2.2 RNAi的特异性 2.3 RNAi的高效性 2.4 RNAi的可扩散性 2.5 RNAi的可遗传性,2.1 siRNA的结构和功能之间存在相关性,dsRNA经过切割形成20一25nt的siRNA，它们具有5 末端的磷酸基，3 末端的羟基和2个突出的单链核苷酸。这种结构对于RNAi是十分必要的。Nykanen等的研究表明平末端的siRNA或失去5 磷酸基团的siRNA不具有RNAi的功能。,siRNA 的三大结构特征是：1、长度为2123nt、2、双链两端各有两个突出的3 碱基、3、5 端有磷酸基团。这些特征使得
16、siRNA有别于其他的dsRNA，这也是细胞能够区分出真正的siRNA和其他dsRNA的分子基础。基于RNAi的这一特性，细胞可以自行监控异常的mRNA，并封闭该基因的表达。,2.2RNAi的特异性,导入生物体的siRNA只能引起同源基因表达的抑制，而无关基因不受影响。而且，在siRNA序列中配对的1921nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNAi有明显的特异性。科学家可以通过制备外源性的siRNA并导入细胞内，特异性地抑制某些基因的过度表达和抑制突变基因的表达，研究基因的功能。,2.3RNAi的高效性,dsRNA在Dicer作用下形成siRNA，siRNA解链与RISC形成复合物，这些RISC可专一性地与靶向的mRNA特异性结合。siRNA也有可能不与RISC结合，而是通过解链直接靶向结合mRNA。根据RISC结合位点或单链siRNA 结合位点在RdRP(RNA依赖性的RNA 聚合酶)作用下可形成新的dsRNA，后者被Dicer特异识别而将dsRNA切断，形成新的siRNA而再循环作用于靶向mRNA。切断后的mRNA或被核酸外切酶所降解，或可能成为异常RNA，在RdRP作用下又形成dsRNA，再次被Dicer识别并切断，形成新的siRNA进一步作用于靶向mRNA。,
