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1、,毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE,一.概述,传统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低.80年代初,细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术毛细管电泳。,毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳 (HPCE),是指离子或带电粒子以毛细管为分 离室,以高压直流电场为驱动力,依据样品中 各组分之间淌度和分配行为上的差异而实 现分离的液相分离分析技术。由于毛细管 内径小，表面积和体积的比值大,易于散 热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产 生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。,毛细管电泳的兴起与发展 1 . 19
2、881989年出现第一批CE商品仪器 2 . 1998年广泛应用于药物分离、脱氧 核糖核酸(DNA) 测定,CE开始主要用于蛋白质，多肽的分析,以后逐渐被广泛应用于生物，化学，医药，环保等领域。它具有分离效率高，分析速度快，样品及试剂用量少,洁净无污染等特点,和HPLC(高效液相色谱法)成为分析化学中互补的技术。随着生命科学的发展，毛细管电泳技术也有了广阔的发展空间.目前，不同分离模式的毛细管电泳技术正成为最重要的生物样品分离分析手段。,二、 毛细管电泳基本原理,CE 是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道，依据组分间淌度和分配差异，实现分离的技术 。,二.毛细管电泳基本原理,1.基本概念,
3、有效长度 (Ld, cm) 毛细管的入口端到检测器窗口的距离；,迁移时间 (tm min)带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；,电泳速度（Ue cm/s） 在单位时间内，带电粒子在毛细管中 定向移动的距离；,电场强度(E V/cm) 在给定长度毛细管的两端施加一电场后所形成的电效应的强度；,电泳淌度（ep cm2/(V.s) ）带电粒子在毛细管中定移动的速度与所在电场强度之比；,电渗流： 毛细管内壁表面的电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用；,电渗流 方向,样品分子泳动方向,1.基本概念,使液体沿毛细管壁均匀移动； 使携带不同电性的分子均向负极移动，中性分子也
4、随着电渗流一起移动。,电渗流的 作用特点,毛细管电泳仪系统,Come on,进样系统,静压力进样和电动进样进样体积一般在纳升级进样长度必须控制在毛细管总长度的1%2%，否则将影响分离效率,分离系统,毛细管:由熔融石英制成,内径通常为2575 m,外径为350400m,有效长度为80100cm;恒温系统:控制柱温变化在0.10C； 高压电源:电流0300A电压030KV,电压稳定性在0.1%;,检测系统,常用的检测方式是紫外-可见光吸收.检测器位于距样品盘约毛细管总长的2/34/5处,对毛细管壁内部分进行光聚焦； 此外，荧光，激光诱导荧光，质谱等检测方法也被应用于毛细管电泳;,高效毛细管电泳仪实
5、图,3.毛细管电泳基本分离原理,毛细管的两端分别浸在含有电解质的储液槽中，管内也充满同样的电解质,其中一端与检测器相连.当样品被引入后,便开始施加电压，样品中各组分向检测器方向移动,溶质的迁移时间为:,tm = Lt2/UV,Lt-有效长度 V-施加电压 U-溶质总流速 Ue-电泳速度 Ueo-电渗流速度,U = Ue/Ueo,其中，,可见，在毛细管长度一定，某时刻电压 相同的条件下，迁移时间决定于电泳速度Ue和电渗流速度Ueo,而两者均随组分的不同荷质比而异;所以,基于荷质比的差异就可以实现组分的分离。,电泳仪工作示意图,三.毛细管电泳的分离模式,CE,毛细管区带电泳（CZE） （capil
6、lary zone electrophoresis）,毛细管凝胶电泳 （CGE） （capillary gel electrophoresis）,胶束电动力学毛细管色谱(MECC)mfcellar electrokinetic capillary chromatography,毛细管等电聚焦电泳(CIEF) capillary isoelelectric focusing,毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会.根据分离原理可分为:,胶束电动力学毛细管色谱(MECC)mfcellar electrokinetic capillary chromatography,胶束电动力学
7、毛细管色谱即毛细管胶束电动色谱,是把一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠, SDS)加到缓冲液中，当其浓度超过表面活性剂的临界胶束浓度后,就会形成有疏水内核、外部带负电的胶束。虽然带负电的胶束的电泳方向是朝着电场的正极，但一般情况下，电渗流的速度大于胶束的电泳速度，故胶束实际上是以较底的速度向负极移动。,MECC技术的最大的特点是使毛细血管电泳有可能在用于离子型化合物分离的同时进行中性物质的分离，因此在各个领域显示了广泛的应用前景。,毛细管凝胶电泳 （CGE） （capillary gel electrophoresis）,毛细管凝胶电泳是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。常用聚丙
8、烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱，可分离、测定蛋白质和DNA的相对分子量或碱基数，但制备麻烦，使用寿命短。,毛细管等电聚焦电泳(CIEF)：,将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。,毛细管等速电泳（ capillary isotachor phoresis,CITP）：,是一种较早采用的模式。选用淌度比样品中任何待测组分的淌度都高的电解质作为先导电解质，用淌度比样品中任何待测组分的淌度都低的电解质作为尾随电解质，夹在先导电解质和尾随电解质之间的样品组分根据各自的有效淌度不同而分离，达到平衡时，各组分区带上电场强度的自调节作用使各组分区带具有相同的迁移速率，故而得名。,毛细管区带电泳,毛细管区带电
9、泳(CZE)也 称为自由溶液毛细管电泳, 是毛细管电泳中最简单， 应用最广泛的一种形式。 其分离机理在于：不同离子 按照各自表面电荷密度的差 异也即淌度的差异,以不同的 速度在电解质中移动,而实现 分离。当然，中性物质的淌 度差为零,所以不能以这种形 式分离。,四.CE技术的应用,毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等,毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，
10、在临床医学等领域的应用也有较多应用。如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。,CE和HGP,目前，人类基因测序已基本完成，人类基因组计划进入后基因组时代。但是，耗资巨大的HGP至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更
11、大的作用。,蛋白质,肽片段混合物,酶切,CZE,分离,特征性肽图,微量制备,CE,分别测定各片段的氨基酸序列,整个蛋白质 的一级结构,CE应用举例-肽的分析,参考文献,仪器分析,吴谋成主编,北京:科学出版社，2003 现代生物样品分离分析方法,张玉奎等编,北京:科学出版社,2003 蛋白质化学与蛋白质组学,夏其昌等编著,北京:科学出版社,2004 毛细管电泳技术发展及应用前景,王雅杰,张银等毛细管电泳原理及在药学领域的应用,卞红平,二维电泳（two-dimensional electrophorese） 及其在蛋白质组学中的应用,主要内容,一、蛋白质组学研究意义与面临的困难 二、二维电泳及其重
12、要性 三、二维电泳的方法与存在的问题 四、二维电泳的进展 五、展望,一、蛋白质组学研究的意义,1、定义：蛋白质组(proteome) ：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定与疾病的关系。 2、意义蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生命现象的本质奠定基础。,蛋白质组学研究所面临的困难,1、细胞种类的多样性 2、细胞的生命周期 3、蛋白质生成的时效性（30万300万种） 4、
13、蛋白质的结构与变异 5、研究方法,二、二维电泳及其重要性,1、定义：二维电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离、等电聚焦：电荷、SDS凝胶电泳：分子大小,二、 二维电泳及其重要性,1、原位细胞提取与样品处理-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线。2、二维电泳是研究蛋白组学的关键技术，是深刻认识蛋白质结构与功能的重要工具。,三、二维电泳方法与问题,方法的主要步骤：1、 样品准备2、第一维：形成pH梯度进行等电聚焦3、第二维：SDS凝胶电泳4、染色： 考马氏亮兰或银染5、图像分析：肉眼
14、或自动扫描,二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DPAGE),二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。,原 理,通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（13 mm）中加入含有两性电解质、8M的脲酶以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30 min，使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖
15、溶液使其固定并与浓缩胶连接。,在第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。,细胞提取液的二维电泳可以分辨出10002000个蛋白质， 有些报道可以分辨出500010000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。,例如将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中，通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较，转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白
16、质斑点，这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。,三、二维电泳方法与问题,重复性差：方法尚未标准化,导致的结果是实验室内部、不同实验室之间难以重复 难定量,四、二维电泳的进展,1、二维平板凝胶电泳的进展 染色试剂：考马氏亮兰、银染、同位素、荧光等 由染色检测到直接紫外检测 肉眼观察 自动扫描 2、平板二维 柱二维电泳（二维CE） 3、平板二维 芯片二维电泳 4、二维电泳 多维电泳,进展之一：（1）荧光染色,FLA-5000-image: Sypro Ruby stained 2 D-gel, brain proteins,二维电泳荧光检测,进展之一：（2）紫外荧光检测,Anal. Chem. 2003,75,157-159,
