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1、实验二 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及定量测定,一、目的要求,1、掌握722型分光光度计的使用。 2、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定。 3、掌握血红蛋白标准曲线的绘制。,二、实验原理,血红蛋白（Hb）与O2结合生成氧合血红蛋白（HbO2），与CO结合生成一氧化碳血红蛋白（HbCO），因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础，如HbO2在可见光波长400600nm范围内有三个特征的吸收峰，其峰值分别在415、541和576nm处，当氧合血红蛋白转为一氧化碳血红蛋白（HbCO），此时光谱发生
2、改变，在波长419、540和569nm处出现三个特征的吸收峰，其中在500600nm范围内三个特征的吸收峰如下图。,本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其光吸收度，以吸光度（A）（又称光密度）为纵坐标，波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。,三、仪器和试剂,1仪器：试管及试管架；吸量管；滴管和 量筒；722型分光光度计；CO发生器。 2试剂： （1） 浓H2SO4；（2）甲酸；（3）蒸馏水； （4）血红蛋白溶液。,722型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定量的分析。该仪器广泛应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，是生
3、物化学实验室常用分析仪器之一,1、722型分光光度计的使用,基本原理,溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理-朗伯-比耳定律,朗伯比尔定律： A=lc,：摩尔吸光系数,c：溶液的浓度,l：液层的厚度,A：物质的吸光度,操作方法,预热仪器,选定波长,调节T=100,固定灵敏度档,调节“0”点,测定,关机,注意事项,该仪器应放在干燥房间内，使用温度为535。远离强电场、磁场,每次做完实验时，应立即洗净比色
4、皿,为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命,当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记,比色皿的使用方法,拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污,洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净,比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸蘸干，以保护透光面,四、实验步骤,1样品的制备： 用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。（1）氧合血红蛋白（HbO2）液：加蒸馏水20ml， 取全血0.1ml（3滴）盛于小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。 （2）碳氧血红蛋白（HbCO)
5、 液： 取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体（浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。,2吸光度测定及吸光光谱曲线的绘制： （1）将如上制备的2种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一次读数均应用空白管调节零点和100%）。（2） 先从波长500600nm分别测定HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。（3）然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异，对722型分光光度计来说，峰值误差在3nm5nm波长内是允许的。,思考题,1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱有何意义？ 2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特征反映它的什么结构成分？ 3、什么叫吸光度、透光度、消光系数及分子消光系数？,
