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1、PCR实验室 检测技术,宁夏动物疾病预防控制中心 2011.08.04,PCR检测技术,一、 PCR技术原理,DNA在细胞中的复制是个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。,PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火)、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。将扩增
2、产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下一般都可见到DNA的特异扩增条带。,二、PCR技术工作流程及注意事项,（一）PCR实验室的布局 PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这也是最容易造成假阳性原因之一。实验室布局应重点考虑避免这种污染。因此用于PCR检测的实验室要进行功能区域划分，从对环境要求的严格程度和功能上可将PCR整个实验流程划分为四个区域：1.配液区（准备区）2.模板提取区3.PCR扩增区4.电泳区,（二）各区操作注意事项,下述操作在该区进行：储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 在本区的实验操作过程中，必须戴
3、手套并经常更换。 操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。,1. 配液区（准备区）,2. 模板制备区,下述操作在该区进行：标本保存、核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。,3. 扩增区,下述操作在该区进行：DNA或RNA扩增。 不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避
4、免气溶胶从本区漏出。 为避免气溶胶所致的污染，尽量减少在本区的走动。,4.电泳区,下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。,（三） PCR实验室设置的原则,注意：唯一流向制度问题 ：要求物流、人流均应严格遵守1 2 3 4路线，严禁倒流。物品的专用与移动问题 ：移液器、吸头和离心管等为PCR专用，各区之间勿串用,三、PCR操作程序,一是P
5、CR扩增模板的制备，也就是病原微生物基因组提取 二是PCR扩增，即目的基因特异扩增过程 三是琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下检测基因片段,*PCR模板的提取,（一）样品的采集及前处理 活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml PBS（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。 组织脏器，取待检样品0.05g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加2ml PBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。 血清、血浆、乳汁、精液或组织渗出液，则直接取用。,（
6、二）提取模板,提取病原微生物基因组是PCR操作成功关键的一步，特别是病原RNA的提取显得非常重要。一般分为两步：1.裂解病原微生物，使病原基因组从病原体溢出。2.纯化病原基因组，去除蛋白质和一些盐类。,（三）病原微生物基因组提取注意事项,1.RNA提取应注意RNA酶（RNase）污染问题，RNase是一种不怕热和不易降解的蛋白质，而且广泛存在于我们工作环境中，对于此酶污染的防治办法主要有两方面：在提取RAN试剂中加入一些RNase 抑制剂 操作过程中保持环境干净、密闭、戴口罩手套操作等。,2.在病原微生物基因组提取时，由于是微量，几乎看不见。所以当离心机离心沉淀RNA和DNA时要记住离心管方向
7、，加入乙醇洗沉淀时要缓慢加入，避免冲掉已提取出来的模板。溶解沉淀时要沿着沉淀部位进行溶解。 3.在病原微生物基因组提取时，应注意实验室环境污染和操作人员安全防护。,（四）实验器材,必须使用PCR专用吸头,试剂盒的运输和贮存,PCR试剂盒在适当的贮存温度下的有效期一般为6个月核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20产物检测部分试剂则贮存于28。,*PCR扩增,（一）PCR反应体系组成 PCR缓冲液(含Mg2) 模板 4种dNTP 引物 Taq酶,（二）PCR扩增程序：,扩增程序实际上是一个3种不同温度的热循环程序。包括高温变性：将病原微生物基因模板94 条件下，使得双链DNA分子变成单链DNA。有利
8、于下一步的引物结合。低温退火：在40至60 条件下，使引物与单链DNA结合的过程。便于下一步新DNA链形成 适温延伸：在72条件下，沿引物合成新的DNA链。在这3个温度条件下循环30至35次，可将病原微生物特定的DNA片段放大百万倍。,（三）PCR扩增注意事项,试剂：尽量分装，不要原瓶多次取用。 加入模板切忌喷雾污染，在吸取液体时，尽量避免用力过快吸取。避免反应成分或模板喷到移液器上，污染移液器和环境。所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。,*琼脂糖凝胶电泳分析,扩增基因片段需要进行琼脂糖凝胶电泳分析，依据扩增DNA片段在电泳中迁移的距离判定其大小，与已知扩增基因片段相比较来判定PC
9、R扩增效果。 在进行琼脂糖凝胶电泳分析时，一般情况下先在凝胶中加1%溴化乙锭（EB)(每100ml加10ul)然后将已经制备好的1%-2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待检样品，同时用分子量标准品作标记。待检样品进入凝胶内溴酚蓝迁移2-3cm后，切断电源，取出凝胶在紫外灯下观察结果。 由于EB可与双链DNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强80-100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。,电泳所需试剂,琼脂糖 溴化乙锭 电泳缓冲液 上样缓冲液 Macker,电泳槽,电泳仪,凝胶成像系统,PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）,
10、琼脂糖凝胶电泳分析注意事项,电泳上样时避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。 用电泳缓冲液制备琼脂糖凝胶。 溴化乙锭（EB）为强致癌物质，必须戴手套谨慎操作，摇动时不要外溅。,四、PCR检测常见问题与解决途径,利用PCR方法检测时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。,（一）假阳性：,造成假阳性的原因 1
11、. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染； 2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。 3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。 4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸
12、样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。,假阳性问题的试验控制,在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。,（二）假阴性,如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注
13、意，许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。,造成假阴性原因：,1.仪器因素 2.试剂质量问题 3.核酸模板问题：模板中含有杂蛋白质；模板中含有 Taq 酶抑制剂；模板核酸变性不彻底等。 4.操作人员素质问题：PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。,假阴性解决方案 1.检查PCR试剂是否失效 2.选择与优化样品DNA提取方法，验证DNA提取试剂是否失效。,（三）污染处理,1. 提取时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。 2. 用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。 3. 玻璃器皿干烤：180 ，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。4. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。,谢 谢！,
