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1、吸附层析,制作人：樊启弟,LOGO,（Adsorption Chromatography）,纲要, 概述,层析法分类,层析的由来与发展,层析分离方法的选择, 吸附层析,吸附柱层析,薄层层析,Key：原理、吸附剂选择、洗脱剂选择、操作,概述,一、层析的由来与发展,1901年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不同色带的光谱现象一样。1906年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，色谱法由此得名。,1931Kuhn
2、, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。 1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。 1938Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。 1944Consden等发明了纸色谱。,1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。 1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并应用于
3、气相色谱。 1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958Golay发明毛细管柱气相色谱。,1、原理,色谱法(Chromatography），也称色层法或层析法(后文中我们称之为层析法）。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。层析不只是分离技术，也是一种分析方法。,2、层析过程,逆流分溶原理示意图,物质Y(Kd=1)的分配情况,溶剂 A,物质Z(Kd=3)的分配情况,溶剂 B,总量,总量,总量,总量,总量,总量,平衡后,转移 1,转移 2
4、,转移 3,分溶管号,转移 4,上相转移,下相转移,上相转移,3、层析方法的共同特点：,层析分离体系都有流动相和固定相两个相。 层析过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。,二、层析法分类,1、按两相物理状态分类：用气体作流动相气相层析用液体作流动相液相层析固定相可以是液体或固体，便可组合成四种主要层析类型：, 气固层析（gas-solid chromatography,GSC ） 气液层析（ gas-liquid chromatography ,GLC ） 液固层析（liquid - solid chrom
5、atography ,LSC) 液液层析（ liquid - liquid chromatography ,LLC ）,2、按固定相的形态分类 （1）柱层析 (column chromatography)固定相装在柱内即为层析柱，根据层析柱的尺寸，结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。（2）平板层析(planar chromatography)固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层层析(TLC)；用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析(PC)。,3、按分离过程物理化学原理分类 （
6、1）吸附层析 (absorption chromatography)用固体吸附剂作层析的固定相，利用样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层析。 （2）分配层析 (partition chromatography)用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。,（3）离子交换层析 （ion-exchange chromatography） （4）凝胶层析 （gel chromatography） （5）亲和层析 （affinity chromatography）,三、层析分离方法的选择,1.
7、 对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它们分子量大、易失活以及具有生物专一和亲合性等特点，选用多糖基质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等）离子交换层析、疏水作用层析、凝胶层析和亲合层析等；2. 对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换层析进行分离较为适宜。,3.氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换层析分离；4.抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用吸附层析或反相分配层析分离。,吸附层析,1. 固定相：层析基质 2. 流动相：洗脱剂(柱层析）、展层剂（薄层层析）,一、常用术语,3.分配系数和迁移率,吸附层析
8、示意图,吸附剂,易吸附分子,不易吸附分子,二、示意图,第一节 吸附柱层析,流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。,一、原理,吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。,二、吸附剂的选择,常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，
9、活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型的吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。,在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。,1. 硅胶,硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物时，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。,柱层析硅胶,变色硅胶
10、（也称蓝胶）是以具有高活性吸附材料细孔硅胶为基础原料经过深加工制成的,细孔硅胶为无色或微黄色透明状玻璃体，它的基本质量参数如下：平均孔距2.0-3.0MM,2. 氧化铝,氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。,活性氧化铝,氧化铝空心球,氧化铝粉,高温氧化铝,氧化鋁絲,3.羟基磷灰石,性质稳定、吸附容量大、适用范围广。,三、洗脱剂的选择,洗脱剂指的是能够驱使固定相中的有效成分和部分杂质沿一定方向有规律移动
11、，并能够使有效成分与其他组成物分开的缓冲液。通常它们也是溶解被吸附样品和平衡固定相的缓冲液。合适的洗脱剂应符合下列条件：,纯度较高；稳定性好；能较完全洗脱所分离的成分；黏度小；易和所需要的成分分开。,四、操作,柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。,（1）我们先把吸附剂装在玻璃柱中（吸附剂用量为分离样品的 30 50 倍），使它形成层析柱； （2）将待分离的样品从柱顶加入（加样时避免冲动基质）； （3）当样品溶液全部流入吸附层析住后，加入洗脱剂。,2、流速与分离效果,流速太慢，前峰拖尾与后峰相连,流速太快，组分分
12、不开,正常的流速使组分完全分离,为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的离子强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法属于离子交换层析)。 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。,第二节 薄层层析,将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布成薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展层，达到分离、纯化、制备、分析鉴定的目的。,一、原理：,二、吸附剂的选择,
13、硅胶：略带酸性，适合于酸性和中性物质的分离。 氧化铝：微碱性，适合于碱性和中性物质的分离。,三、薄层板的制备,薄层板常用的制作方法有：1、浸涂法：将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液在玻璃板上形成薄层。 2、喷涂法：用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层。,3、倾斜涂布法：将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成薄层。4、推铺法：在一根玻璃棒的两端适当距离处分别绕几圈胶布条，胶布条的圈数视所需薄层厚度而定，然后把准备好的支持剂倒在玻璃板上，用玻璃棒压在玻璃板上，将支持剂均衡地向一个方面推动，而制成薄层。,薄层板涂好后，让其自然干燥后方
14、能使用。若为吸附薄层层析，制好板后还需加热活化，目的是使其减少水分而具有一定有吸附能力。 （1）薄层的厚度与 Rf 值 薄层厚度200M，Rf基本不变 （2）薄层的活化 100C,1h （3）薄层的活性测定,硅胶薄层薄板的活性测定,苏丹黄、苏丹红、靛酚蓝在活化的薄层薄板上的层析行为,A B C D,（3）薄层的活性测定,四、展层剂的选择,1、种类单一溶剂、混合溶剂 2、要求使样品组分很好地溶解与样品不发生化学反应将混合样品较好分离易挥发、粘度小、组成简单临时新配，只使用一次展层剂的极性 在同一支持介质上，溶剂极性愈大，对同一化合物的洗脱能力也愈大，即在薄板上被推进得愈远，Rf值愈大。,不同展层剂对物质的分离影响,咖啡酸与绿原酸在极性不同的展层剂中的分离效果,五、操作,1、制备薄层板 2、点样：点样斑点小，点样量适当 3、展层：在展层剂中使组分分层 4、显色：薄层层析展开后，如果样品本身有颜色，就可直接看到斑点所在位置。若是无色物质 ，可用显色剂显色，也可用紫外光显色。,薄层色谱法 (Thin Chromatography),六、优点,1、时间短（分钟）2、设备简单、操作方便3、温度和溶剂饱和度对f影响小4、灵敏度高,七、应用,小分子物质的鉴定与制备,THANKS!,
