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1、细胞培养基本技术,细胞培养的基本概念,传代培养（transfer） 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养（primary culture） 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,原代培养细胞的生命归宿,原代培养期 传代期 衰退期,有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于
2、各种实体瘤细胞 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟4小时,贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期结束。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清：有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。
3、细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性,指数生长期是最佳实验期 !,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境温度: 37 O2CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-pH: 7.2-7.4渗透压3 无污染4 无毒,实验准备,实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板
4、， 冻存管,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微
5、松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ，14 h)。 箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔板震荡器,培 养 板,培养瓶,浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,常用玻璃器皿清洗,清洁液的配制,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml,细胞培养用液的配制,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细
6、胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,消化液：,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染,合成培养基: 合成培养基
7、是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,一般说来含5小牛血清的培养基对大
8、多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20
9、多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,向无血清培养液中添加能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清FBS、新生牛血清NBS、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌
10、、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 40nm-0.22mm 微孔滤膜,抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素P.链霉素S.联合使用。培养基内P.S.最终使用浓度为每毫升100单位或微克。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定 比较合理的建议是，在常规的细胞培养中不要使用抗生素。只有在培养污染源很多（比如组织培养），或者培养非常珍贵的细胞株时才使用抗生素,完全培养基的组成,基础培养基(1640或DMEM) 80一95 血清 5一20 NaHCO3 2.0 3.7 g/L P.
11、 S. 各100单位毫升 HEPES 2.0 5.98 g/L,培养基的配制,RPMI-1640/DMEM培养粉 1袋碳酸氢钠 2.0 g青、链霉素 各100单位毫升加三蒸水 至 1000ml, 4过夜过滤除菌。调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）,细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1. 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2. 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3. 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,贴壁生长细胞传代方法：,1. 吸光培养瓶中的培养液 2. PBS洗一次3.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7. 将后者放入培养箱中培养。,
