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1、微生物学实验,生物工程类,实验要求,课前充分预习，上课不无故缺席，实验报告要及时上交。实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。实验器材专人专用，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。实验菌种和物品未经许可，不得携出室外，用后的菌种按老师要求妥善处理。维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。,实验报告要求,统一用A4纸手写实验报告 封面格式1、实验课程名称2、实验项目名称3、学生所在的专业、班级、姓名、学号4、实验日期5、同组者姓名,实验报告格式1、实验目的2、实验原理3、实验仪器、溶液试剂4、实验步骤5、实验结果（如绘图、列表等）6、思考题,实验成绩的组成平常成绩30 （实验操作表现、实验报
2、告）操作考试30笔试成绩40,实 验 内 容,土壤中微生物的分离纯化与活菌计数 显微镜的使用及酵母菌、放线菌的形态观察 霉菌的形态观察 油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色 微生物大小测定、显微镜直接计数法 微生物生理生化反应 水中细菌总数和总大肠菌群的测定 微生物的紫外诱变,（一）培养基的制备与灭菌,实验一、土壤中微生物的分离纯化与活菌计数,一、培养基的制备,目的要求 明确培养基的配制原理 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤,按培养基的用途分 基础培养基 鉴别培养基 选择培养基,按培养基的物理状态分 固体培养基 半固体培养基 液体培养基,按成分不同分 天然培养基 合成培养
3、基 半合成培养基,基本原理,培养基的配方,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（一种天然培养基，用于分离和培养细菌）,配方： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 20g 水 1000ml pH 7.2-7.4 灭菌 121 20min,高氏号培养基（一种合成培养基，可用于培养放线菌）,配方： 可溶性淀粉 20g KNO3 1g NaCl 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 20g 水 1000ml pH 7.27.4 灭菌 121 20min,固体淀粉培养基（一种鉴别培养基，用于大分子物质水解的生理生化鉴定）,配方：蛋白胨 10g氯化钠 5g牛
4、肉膏 5g可溶性淀粉 2g蒸馏水 1000ml琼脂 1520g灭菌 121 20min,器材,溶液或试剂 4mol/L NaOH，1mol/L HCl，各类培养基的配方药品。仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.59.0)，硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。,操作步骤（一）,1 计算 ：根据配方按照用量计算。 2. 称量： 3溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。 4、调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节，以pH试纸或pH计测定。 5过滤：趁热用四层纱布过滤。,操作步骤（二）,6.分装 试管：固体不超过试管高度的 1
5、/5；液体、半固体不超过试管高度的1/4或1/3 。 三角烧瓶：总体积的一半为限。管口或瓶口不得沾有培养基,操作步骤（三）,7.加塞,1.正确；2.管内部分太短，外部太松；3.外部过小,操作步骤（三）,8.包扎：注明培养基的名称。 9.灭菌 ：按各自培养基灭菌的温度、时间灭菌。 10.搁置斜面 (1/3l/2，不能超过1/2)。,11.无菌检查,实验无菌器皿的准备无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水， 经121 20min灭菌。无菌移液吸管、培养皿：报纸包扎后，经121 20min灭菌。,了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。,目的要求,二、消毒与灭菌,灭
6、菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。,基本原理,干热灭菌 火焰灼烧法 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法 加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌,火焰灼烧法,直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。,干热灭菌法,设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170，维持2小时 注意事项： 温度不可超过180，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。 灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。 灭菌物品
7、不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 电烘箱内温度70时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。,2.湿热灭菌(一）,高压蒸汽灭菌法 ：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa，121保持1530min进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。,在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。,原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。,蛋白质含水量与凝固所需温度的关系,原因二：湿热的穿透力比干
8、热大。,原因三：湿热的蒸气有潜热存在。,在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，所以排气是否完全很重要。,间歇灭菌法： 应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热10030min、连续三天，可彻底灭菌。 煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒时间为1015min。 超高温杀菌： 此法指在温度和时间标准分别为135150和28s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。,2.湿热灭菌(二）,高压蒸汽灭菌法,操作步骤（三）,手提式高压蒸汽灭菌锅,全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅,操
9、作步骤（三）（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）,1.装锅先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭菌物品。 2.加盖 将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。 3.灭菌 加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至l21时维持1520min。 4.降温取物 灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，开盖取物。,加压蒸汽灭菌法,0.1MPa，121，20min灭菌 注意事项： 切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。 压力一定要降到“
10、0”时，才能打开排气阀，开盖取物。 灭菌全程必须有人看守。,紫外线灭菌法,适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。 紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。 若紫外线照射与3%5%的石炭酸溶液或2%3%的来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。 注意事项： 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。,过滤除菌法,适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性物质）。 滤膜孔径：0.22m 缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。,思考题,培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？ 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题,为什么？ P27（1） 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。P27（2） 在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？P27（3）,
