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1、基因工程,识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。,4000种。,形成两种末端,一、 “分子手术刀” 限制性核酸内切酶,二、 “分子缝合针” DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,“分子缝合针”DNA连接酶,1、作用：恢复被限制性内切酶切开了的两个的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,
2、2、分类：从大肠杆菌中分离得到从T4噬菌体分离得到,3、区别：E.coli连接黏性末端T4既能连接黏性末端，又可以连接平末端（效率低）,“分子运输车”基因进入细胞的载体,1、常用载体：质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒2、质粒：最常用的载体是一种裸露的、结构简单、独立于拟核之外、并具有自我复制能力的双链DNA分子,基因工程的基本操作程序主要包括 四个基本步骤：,1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定,返回,2目的基因与运载体结合,首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现 一个切口，露出黏性末端。,然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生 相
3、同的黏性末端。,将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处， 再加入适量DNA连接酶，质粒的黏性末端与 目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互 补配对而结合，形成了一个重组DNA分子。,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞-转化,3将目的基因导 入受体细胞,受体细胞：细菌,细胞壁的通透性增大,重组质粒进入受体细胞,目的基因随受体细胞的繁殖而复制,氯化钙,基因工程中常用的 受体细胞有大肠杆 菌、枯草杆菌、土 壤农杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。,受体细胞的选择,1、原核生
4、物细胞：,（1）优点：容易摄取外界的基因（目的基因），繁殖快，便于培养和基因操作,（2）主要生物：大肠杆菌、蓝藻,2、真核生物细胞：,主要生物,酵母,植物细胞活的植物离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株（转基因植物）,动物细胞常采用生殖细胞、受精卵细胞或胚胎细胞（转基因动物）,返回,步骤四：目的基因的检测与鉴定,四、目的基因的检测与鉴定,1、检测与鉴定的目的,目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性,检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上,2、,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,另外：个体生物学水平的鉴定,思考：检测mRNA
5、 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？,#检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,#个体生物学水平的鉴定,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,基因工程的应用,农牧业 工业 环境保护能源 医药卫生,1973年,由美国科学家科恩等人用重组DNA技术首次获得转基因大肠杆菌。从此以后，基因工程作为一个新兴的研究领域得到了迅速的发展:,一、植物基因工程硕果累累,转基因工程技术主要用于提高浓作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.,基因工程在农业上的应用：,1）
6、高产、稳产和具优良品质的品种用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。如“向日葵豆”植株。 2）抗逆性品种将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。,迄今为止，人们已获得了数百种转基因植物：抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆、作物的高产优质、果蔬储存、作物的固氮能力、药物生产及环境美化等,转基因马铃薯,1.抗虫转基因植物,2.抗病转基因植物,3.其他抗逆转基因植物,4.利用转基因改良植物的品质,畜牧养殖业：培养具有各种优良品质的转基因动物（具有抗病能力、高产仔率、高产奶率、高质量的皮毛）,方法：将某些特定基因与病毒DN
7、A构成重组DNA，然后通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中,动物基因工程前景广阔,二、动物基因工程前景广阔,1.用于提高动物生长速度,2.用于改善畜产品的品质,3.用转基因的动物生产药物,1、传统制药：直接从生物体的组织、细胞或血液中提取,例：45克/100公斤猪、牛的胰腺,缺点：产量低、价格昂贵,2.“工程菌”制药,（1）什么叫“工程菌”？,用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。（如：含有人胰岛素基因的大肠杆菌菌株、含有抗虫基因的土壤农杆菌菌株）,例：100克/2000升大肠杆菌培养液,（2）优点：高质量、低成本,（3）基因工程药品：60余种,生长激素释放抑
8、制素参与生长的调节可用来治疗肢端肥大症、急性胰腺炎等疾病胰岛素治疗糖尿病 TPA（组织纤维酶原激活剂） 治疗心脏、肺、脑血栓病 EPO（促红细胞生成素）治疗肾功能受损 引起的贫血、出血 白细胞介素-2治疗肿瘤和感染性疾病还有干扰素、生长激素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品、基因疫苗等等,繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质的转基因动物。该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中。,基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？,将人的生长激素基因和牛的生长素基因分别注射到小白鼠受精卵中，得到的“超级小鼠”。,用口径为1m的DNA注射器，将大量的
9、目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。,什么叫显微注射技术？,在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？,药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。,传统生产方法的缺点,由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。,可利用什么方法来解决上述问题？,利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取45g胰岛素。用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。197
10、9年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。1982年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%50%。,基因工程药品 胰岛素,干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每300L血液只能提取出1mg干扰素。19801982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市场。,基因工程药品 干扰素,日本生产的
11、干扰素,干扰素治疗30多种有病毒传染的疾病，如：水痘、乙型和丙型肝炎、狂犬病，也可治疗乳腺癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、脑瘤等常见病、多发病。其中，-干扰素对爱滋病的治疗也有一定的疗效。,治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,基因工程药品 生长激素,转基因动物的乳腺。,就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？,是指把人或哺乳动物的
12、某种基因导入到哺乳动物(如鼠、兔、羊和猪)的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。这样一种新的个体，称为转基因动物。,什么叫转基因动物？,1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。,为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？,4.用转基因的动物作器官移植的
13、供体,5.基因工程药品异军突起,1.植物基因工程硕果累累1）抗虫转基因植物2）抗病转基因植物3）抗逆转基因植物4）改良植物品质 2.动物基因工程前景广阔1）提高动物生长速度2）改善畜产品质量3）生产药物4）用转基因动物作器官移植的供体 3.基因工程药物异军突起,4.基因治疗曙光初照1）基因治疗的种类和方法：体外基因治疗：eg.腺苷酸脱氨酶基因的转移体内基因治疗：2）基因治疗的现状：,基因诊断：,也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。探针制备：放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子；原 理：利用DNA分子杂交原理；,1、基因诊断：
14、用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA分子作探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被测标本上的遗传信息。,-珠蛋白的DNA探针检测镰刀型细胞贫血症 苯丙氨酸羟化酶基因探针检测苯丙酮尿症 肿瘤诊断：白血病癌基因制备的探针 检测白血病,基因探针：,基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。,DNA分子杂交原理：,DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为
15、探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。,2.基因治疗：,是指是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,患半乳糖血症的患者，由于细胞内半乳糖苷转移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶，使过多的半乳糖在体内积聚，引起肝、脑等功能受损。1971年，美国科学家在体外做了试验，用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的方法治疗这种遗传病是可能的。,首例基因治疗的受益者 （美国1991年）,到1998年底，世界范围内累计3134人接受了基因转移试验,神奇的基因芯片,基
16、因工程与食品业,基因工程为人类开辟新的食物来源。1）鸡蛋白基因在大肠杆菌和酵母菌中表达获得成功。这表明，未来能用发酵罐培养的大肠杆菌或酵母菌来生产人类所需要的卵清蛋白。2）用基因工程的方法从微生物中获得人们所需要的糖类、脂肪和维生素等产品。,基因工程为食品工业中提供了什么前景？,基因工程与环境保护,1）用于环境监测。 2）用于被污染环境的净化。,基因工程在环保方面有什么应用？,例如：用DNA探针可以检测饮用水中病毒的含量。此方法的特点是快速、灵敏，1吨水中有10个病毒也能检测出来。,通过基因工程方法怎样进行环境监测？,基因工程与环境保护,应用：环境检测、被污染环境的净化,环境检测DNA探针检测饮用水中病毒的含量 优点快速、灵敏、精确度高,
