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1、DNA提取和常见问题 分析及对策 主讲人： 关锰 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 DNA简单介绍 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达，获得 高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 D D DN N NA A A提提提取取取原原原则则则 保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低 程度 排除其他核酸分子的污染 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交
2、流、资源共享与互助社区 D D DN N NA A A提取的提取的提取的几几几种方法种方法种方法 一、染色体DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 D D DN N NA A A提提提取取取的几的几的几种种种方法方法方法 二、非染色体DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六 烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞 膜， 并与核酸形
3、成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的， 通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后 加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷 的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 CTAB法流程图 植物材料 裂解液异丙醇沉淀 液氮研磨抽提离心洗涤 DNA溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 CTAB中各个组分的作用 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl （pH
4、8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使 酚容易去除。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与 多酚 形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 除蛋
5、白质： 氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程 中出现的气泡）。 使用变性剂变性 (SDS.异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 除多糖： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积 的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以 与多糖的羟基作用，从而去除多糖。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 除酚类物质： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基 乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸
6、.二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP.PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类 与DNA的结合 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 除盐离子： 70的乙醇洗涤 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 TE中成分的作用 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 称取样品，液氮研磨，加入预热的(65 ) CTAB及-巯基乙醇 保温1h,期间不停的摇均 吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇
7、（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min 取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 /-20 保温沉淀 10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 应注意的问题 材料准备： 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。 液氮研磨： 研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程 中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带 来的降解。此外尽 量将样品研磨的很
8、细，这样可以提高 DNA产量。 细细细胞胞胞裂裂裂解解解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA 量少，纯度低。 高温温浴时，定时轻柔振荡。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 应注意的问题 DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙 醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。 DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。 DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 基基基因组因组因
9、组D D DN N NA A A的的的检检检测测测 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 g/ mL 双链 DNA， A260/280 约为1.8 D D DN N NA A A提取常提取常提取常见见见问题问题问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 1 1. . D DN NA A中中含含有有蛋蛋白白、多、多 糖糖、多多酚酚类类杂杂质质 2 2. . D DN NA A在在溶溶解解前前，有酒有酒 精精残残留留，酒酒精精抑制抑制 对 后后续续酶酶解解反应反应 策 3 3. . D DN NA A中中残残留留有有金金属离属
10、离 子子 4 4. . 有有R RN NA A的的存存留留 重重新新纯纯化化D DN NA A，过过吸吸附附 柱柱去去除除蛋蛋白白、多多糖糖、 多多酚酚等等杂杂质质 重重新新沉沉淀淀D DN NA A，让让酒酒精精 充充分分挥发挥发 增增加加7 70 0乙乙醇醇洗洗涤的涤的 次次数数（2 2- -3 3次）次） 加加入入R RN Na as se e降降解解R RNANA 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 D D DN N NA A A提取常提取常提取常见见见问题问题问题 问题二：DNA降解。 原 因 1 1. . 材材料料不不新新鲜鲜或或反反复复冻冻 融融 2 2
11、. . 未未很很好好抑抑制制内内源源核核酸酸 酶酶的的活性活性 对 策 3 3. . 提提取取过过程程操操作作过过于于剧剧 烈烈，D DN NA A被被机机械械打断打断 4 4. . 外外源源核核酸酸酶酶污污染染 5 5. . 反反复复冻融冻融 1 1. . 尽尽量量取取新新鲜鲜材材料料，低低温温保保存存材材料料避避 免免反反复复冻冻融融 2 2. . 液液氮氮研研磨磨或或匀匀浆浆组组织织后后，应应在在解解冻冻 前前加加入入裂裂解解缓缓冲冲液液 3 3. . 在在提提取取内内源源核核酸酸酶酶含含量量丰丰富富的的材材料料 的的D DN NA A时时，可可增增加加裂裂解解液液中中螯螯合合剂剂 的的
12、含含量量，细细胞胞裂裂解解后后的的后后续续操操作作应应 尽尽量量轻轻柔柔 4 4. . 所所有有试试剂剂用用无无菌菌水水配配制制，耗耗材材经经高高 温温灭灭菌菌 5 5. . 将将D DN NA A分分装装保保存存于于缓缓冲冲液液中中，避避免免 反反复复冻冻融融 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 D D DN N NA A A提取常提取常提取常见见见问题问题问题 问题三：DNA提取量少。 原 因 1 1. . 实实验验材材料料不不佳佳或或量量少少 2 2. . 破破壁壁或或裂裂解解不不充分充分对 策 3 3. . 吸吸附附或或沉沉淀淀不不完全完全 4 4. . 洗洗涤涤时时D DN NA A丢失丢失 1 1. . 尽尽量量选选用用新新鲜鲜（幼幼嫩）嫩） 的的材材料料 2 2. . 植植物物要要匀匀浆浆研研磨磨充充分分 3 3. . 增增加加吸吸附附的的时时间间，或低或低 温温沉沉淀淀 4 4. . 小小心心操作操作
