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1、工程菌的高效表达与稳定性,080921班 王改改 楼春燕080922班 郑翡 韩湘茹,2010.9.27,生物制药学,目录,大肠杆菌体系中的基因表达,2010.9.27,生物制药学,概述,目的基因获得以后，必须在合适的工程菌中表达，才能获得目的产物。 工程菌要高效表达，应满足以下的条件：具有高浓度，高产量，高产率；能利用易得廉价原料；不致病，不产生内毒素；发热量低；容易进行代谢调控；容易进行重组DNA技术；产物易纯化。 理论上各种微生物都可以用于基因的表达，但由于克隆载体，DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的工程菌仍然是大肠杆菌和酵母菌。,2010.9.27,生物制药学,大
2、肠杆菌,真核基因要在大肠杆菌中复制与表达，必须要有合适的表达载体把真核基因导入工程菌中，然后将外源基因表达成蛋白质，根据真核基因在原核基因中表达的特点，表达载体必须具有一些特点，如能够独立复制，具有很强的启动子和终止子等。,2010.9.27,生物制药学,大肠杆菌高效表达的相关因素,外源基因的剂量： 一般来说细菌内基因拷内数增加，基因的表达产物也增加。 载体在工程菌中的拷贝数直接关系到外源基因的拷贝数。 外源基因的表达效率： 转录水平的高低是决定该基因能否高效表达的基础，而转录水平受到启动子等调控元件的控制。 核糖体结合位点的有效性。,2010.9.27,生物制药学,大肠杆菌高效表达的相关因素
3、,SD序列和起始密码的间距。 密码子组成。 表达产物的稳定性： 组建融合基因，产生融合蛋白。 利用大肠杆菌的信号肽把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中，此时外源蛋白质不易被细菌酶类降解。 采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性。 采用蛋白酶缺陷的大肠杆菌，有可能减弱表达产物的降解。,2010.9.27,生物制药学,大肠杆菌高效表达的相关因素,细胞的代谢负荷： 外源基因的表达产物属于异已物质，可能对工程菌具有毒性作用，所以应合理调节这种消长关系，使工程菌的代谢负荷不致过重，又能高效表达出外源基因的产物。 将工程菌的生长与重组质粒的复制分开。当工程菌迅速生长
4、时，抑制重组质粒的复制；当细胞生长到一定程度后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加拷贝数。,2010.9.27,生物制药学,大肠杆菌高效表达的相关因素,工程菌的培养条件： 外源基因的高水平表达，不仅涉及工程菌、载体和克隆基因三者之间的关系，而且与其所处的环境条件息息相关，必须优化基因工程菌的培养条件，进一步提高表达效率。,生物制药学,酵母体系中的基因表达,酵母是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，其基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。 酵母繁殖迅速，可以廉价地大规模培养，而且没有毒性。基因工程操作与原核生物相似。 目前已有不少真核基因在酵母中获得成功克隆和表
5、达，如干扰素、乙肝表面抗原基因等。,2010.9.27,生物制药学,2010.9.27,酵母体系中的基因表达,酵母和其它表达系统一样，表达系统也包括载体、启动子等控制序列和宿主细胞三个主要部分。 （一）表达载体 酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保持和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。,2010.9.27,生物制药学,酵母菌体系中的基因表达,1、载体的复制序列 根据载体中来自酵母的复制序列的构成和特性，可以归纳成YEp类、YRp类、YCp类、YIp类4大类 2、克隆载体 从大肠杆菌中制备制粒比酵母中容易很多，因此酵母制粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只是在最后
6、阶段才转入酵母中，这就是要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和繁殖的能力,2010.9.27,酵母菌体系中的基因表达,3、表达载体 将酵母的启动子和终止子等有关的表达控制序列引入上述载体的适当位置后，就构成了酵母的表达载体,生物制药学,2010.9.27,酵母菌体系中的基因表达,（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1、外源基因的剂量 由于外源基因通常是由多拷贝的质粒载体导入宿主细胞的，所以质粒的拷贝数及其在宿主细胞内的稳定性对外源基因的表达起决定作用,生物制药学,2010.9.27,酵母菌体系中的基因表达,2、外源基因的表达效率 （1）启动子 （2）分泌信号的效率 （3）终止序列的影响,
7、生物制药学,2010.9.27,生物制药学,酵母菌体系中的基因表达,3、外源蛋白的糖基化 酿酒酵母能使表达的外源蛋白在分泌过程中发生糖基化 外源蛋白在酵母细胞中可发生的N-糖苷键（天冬酰胺连接）和O-糖苷键(丝氨酸或苏氨酸连接）连接的两种不同的糖基化，这与哺乳动物中发生的糖基化相同。,生物制药学,2010.9.27,酵母菌体系中的基因表达,4、宿主菌株的影响不同的酵母宿主菌株及其生理状况对外源基因的表达有明显的影响。对于表达用的菌株因具备下列要求： 菌体生长力要强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌株性能要稳定 分泌能力要强,生物制药学,2010.9.27,目前的工程菌除了大肠杆菌和酵母菌外，经常用的还
8、有枯草芽孢杆菌、链霉菌、丝状真菌等,2010.9.27,生物制药学,质粒的不稳定性,基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，带有外源基因的表达重组质粒转化入宿主细胞构建的工程菌, 在繁殖传代过程中往往会造成外源插入基因的消除、重组表达质粒的丢失现象, 直接影响表达产物的量。 质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。基因工程的稳定性至少维持25代以上。,2010.9.27,生物制药学,分裂不稳定性,概念：基因工程菌的质粒不稳定常见的是分裂不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。 相关因素：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性
9、与培养条件有关；二是这两种菌比生长速率差异的大小。由于丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势，一旦发生质粒丢失，含质粒菌在培养液中的比例会随时间快速下降，从而被丢失质粒的菌逐渐取代。,2010.9.27,生物制药学,结构不稳定性,概念：质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。 相关因素：质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；在无同源性的两个位点之间也会发生缺失；培养条件也会对质粒结构不稳定性产生影响。 问题：怎样测定质粒的不稳定性？,2010.9.27,生物制药学,二、质粒稳定性的分析方法,工
10、程菌的稳定性,具有良好稳定性的工程菌： （1）工程菌对外源质粒有较好的兼容性； （2）重组质粒结构稳定，不易发生缺失、插入或重排，能够保证构建基因的稳定性； （3）重组质粒表达较大，有利于该质粒在宿主菌中稳定共存。,2010.9.27,生物制药学,提高质粒稳定性的方法,为了提高基因工程菌的稳定性，可采取以下主要方法。 1、选择合适的宿主菌 2、选择合适的载体 3、选择压力 4、分阶段控制培养 5、控制培养条件 6、固定化,2010.9.27,生物制药学,1、选择合适的宿主菌,宿主菌的遗传特性对质粒的稳定性影响很大。宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等
11、都会影响质粒的稳定性。,2010.9.27,生物制药学,2、选择合适的载体,含低拷贝质粒的工程菌：产生不含质粒的子代菌的频率较大，因而对这类工程菌增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性。含高拷贝质粒的工程菌：产生不含质粒的子代工程菌的频率较低，但对质粒的稳定性不利。对同一工程菌来说，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数。,2010.9.27,生物制药学,二、提高质粒稳定性的方法,2010.9.27,生物制药学,3、选择压力,在培养基中加选择性压力如抗生素等，是工程菌培养中提高质粒稳定性常用的方法。含有抗药性基因的重组质粒转入宿主细胞，基因工程菌就获得了抗药性。发酵时在培养基中加入适量的相应抗
12、生素可以抑制质粒丢失菌的生长，消除重组质粒分裂不稳定的影响，从而提高发酵生产率。但是添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力。添加抗生素在大规模生产时并不可取，加入大量的抗生素会使生产成本增加，另外添加一些容易被水解失活的抗生素只能维持一定时间。,2010.9.27,生物制药学,4、分阶段控制培养,外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定 。由于外源基因高效表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制，即在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免由于基因表达造成质粒不稳定性问题的发生，使质粒稳定地遗传，在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。,2010.9.27,生物制药学,5、控制培养条件,工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大。通过控制环境参数（温度、溶氧、pH、限制性营养物质浓度及有害代谢产物浓度等），调节比生长速率，使工程菌生长具有优势。,2010.9.27,生物制药学,6、固定化,固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性。基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的基因产物的产率都有了很大的提高。在游离重组菌系统中常用抗生素、氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。,Thank You !,常用的酵母启动子,2010.9.27,生物制药学,
