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1、华江师范大学博士学位论文中华绒螯蟹蛋白质营养生理研究姓名：陈立申请学位级别：博士专业：动物学指导教师：江洪波2003.4.1学位论文独创性声盟毒入鼹至交鳃学位稔文是亵雀睾努鼹措导下避嚣舞翳宠王传覆取祷瓣爱竟成苯据裁所知，除文中B 经注明引用的内鏖外。本论文誉包含其他个人B 经发袭或撰写进的研究成果对本文昀研究做出重要赏献的个人和集体，两巴雀文中嚣了饔穰说谚并袭拳逶意捧者鍪罐：i 型塑垦。爵辩：二! ：! 兰!学位论文使用授权声明本人崽全了解华泰赙越大学霄关保鬻、使用学位论文的规定，学校有救保留学位语文并向葺东主管帮汀或英槽定撬祷遂交论文酶电子版和羝篇版霄投将学位论文舞予嬖纛葶l | 嚣舞曲夕重
2、复朝筹龛羚论文遗叭学校辫书案教塞楚。鸯教甍学健论文的肉客藕入宥关救据库进行检索宥权将学位论戈的标麓和捕要汇编出敷黎塞酶学壁论文在筹密垂适建謇蒺楚学位论文作者签名：泗I 荡? 茯导师鍪霭：蓦蘩：蝣轰强毒簪嚣辩：致谢在华东师大攻读博士学位的四年中，我得到了导师陈立侨教授的悉心指导、大力鼓励程无徽不至懿关弼。论文麸选嚣、实验凌诗、实熬裂论文靛撰写郝凝聚了陈老师的汗水和心血。陈老师严谨的治举态度，渊博的专业知识，敏锐的科学限先，瑷诚待入的豁格，使我深受教益，燕我终生学习静耩模。毽侵我更潮瑾解了“师之所存，逆之所存”的真谛，在此深表衷心的谢意!同时诚挚地感谢堵南【n 教授、赖伟教授两位先生的热情指导和谆
3、谆教诲，他们宠上体现出来的老一辈科学家的治学态发和学纛风范，俊撂我终生学习!在学习、工作和生活中，还得到了周忠良副教授、赵云龙教授、顾福康教授、王群裂教授、| | 砉慰舞副教授、_ | 砉夔平老甥、李瞧老 | ；帮吴剿生老爨懿大力支簿积关心，他们在试验设计和实施以及论文撰弼过程中提出了许多宝贵而具建设性的意觅。在魏表示感谢!本组滋小波、艾春香、高露姣、杜世奄、孟凡丽、杨再福、陈明、宋兵、曾小箴、蔡秣芳、刘彰、罗文、李廉、刘立鹤、于静、田华梅、王鞠由、餐宝军、倪娟、赵晓勤、禹娜、赵掇英、马强、李二超、周永奎、予丰军、孙竹筠、戴更辉、林宜舟、任华和丁银娣等师兄弟和师姐妹，以及孙军、王瑞刚、徐正强和
4、杨玉拣等好鬏在多方嚣绘予了大力支潦袭裁麟，在鼗一芳致滋。深深感谢我的母亲、媳姐、姐夫及兄弟姐妹在我多年求学路上给予我的关心、支持鞍帮麓! 茏冀建我生瘸麓阀繇表魏斡浓浓亲碡镬我能联弱完或学位论文，在此裳示谢意!对一奁关心、焱励、支待和帮助我的所有弼友袭示最诚挚的谢意!江洪波2 0 0 3 每4 月于华东蜂大主塞塑墨主塑墼苎型娄笪堕丛惹兰蹩婴! ! 一中华绒螯蟹蛋白蔟营养生理研究中文摘要中华缀螫餐( E r i o c h e i r s i n e n s i sH 。M i i n e - - E d w a r d s ) 豁舔溽蟹，隶嚣予学壳纲( C r u s t a c e a ) ，
5、十足目( D e c a p o d a ) ，方蟹辩( C r a p s i d a ) 。绒螫蟹属( E r i o c h e i r ) ，是我国特有的水产养殖珍品。广泛分布予我国糸南部沿海的成淡水或淡水水域孛，l 起辽涎、毫至甄选均奏撼产，蠢戳长江渡域繇产瑟矮为最臻。强茭营养丰富、肉昧鲜美、风味独特，倍受国内外市场青睐。蛊上个落纪9 0 年代戳来，箨蟹妲己成为我躺淡水养戆的重要产渡。随着河蟹养殖瓣集约纯霸簸模囊：发震，在实际垒产过耧串壅现了一系捌豢符解决的阖题，如雌骚亲体的性腺发育不良，抱卵率下降，寒蟹利用效率较低；嫠靴培育过程中，胚胎发育死亡率高，且幼体育成率低，质优量足的苗种供
6、成不足：营养素懿不平鬻鼯致残蟹罄蓬遗程串鹃蛙晕熟等，黎严蕊裁终了涎蟹养戆产激豹键瘫、稳步发照。究其原滋，这魑闻繇均与海蟹本身的黛理譬誓性、营养霭裳，以及亲蟹培育期采能获取合理的营养素等有赢接关系。而这些问题的解决则要求甜中华绒螫嫠生麓避裰中的掇食和潜纯燕遴褫翎，豢体性戒熬潮对各种必需营养索( 籍必需氮基酸、必篱脂肪酸和维生素等) 的需求，卵纲照发生过提中营葵物成的合成、转运及贮存舰律，以及在鼹精卵、胚胎和厨续以内源性营养为主的潘状幼体发育狳毅对露黄磷蛋塞戆瀵耗耱瘸掰模式等琢节遴行较麓深入鹣谤究，在全嚣系统缝了麟孛霉缄蝥蟹的生建营养生璞豹蕊疆土，探讨裴转缴殖营券对舞矮、瓣纯及螽续幼体生长发育的影
7、响。蛋白族怒渤物体内维持正常结构和功能的嵇质基础，其生理俸用主簧有：力规体豹生长和发育提供原料，躅予搀建有枫髂的器官、组织_ 秘缨黥等缝擒 在鼗谢_ i 过程中调节弗控制生命活动；可通过分解作用为机体多项生理过程掇供能量。露前富美经济虾蟹不葡生妖阶段的蛋白质营养需簧静磷究较多。研究发现虾缀对蛋鑫质黪营养嚣求与多耱内努羧豢密甥穗哭，如生长发弯懿玲段、生毽状潺、键料夤白源及其生存环境等。对处于生殖季节的虾掇而裔，饵料蛋白质消化吸收后，一部分用予合成体内的生理谲节物质，如酶和激素等，可诱导亲体的成熬，促进蛙壤交酝：另部分舞l 锺予含贱蠖纲悲发磐疑嚣黔营葵携藤，笼萁是会戏费荧磷蛋翻，有刹予提高鲫质和辩
8、细胞数目，维持正常的受精作用斧丑胚胎发育过程，从而增加幼体的存活率。然而迄今，有关蛋自质营养对虾蟹繁殖作用的影响却鲜见报道。簪东师范天学2 0 0 3 鞴簿 学键论文麓站，本疆突在莠凌中华绒螯蟹叁熬条件下癸鬃发蹇j 蕊程中嚣漩豫窝辩鬃筑蛋白质含嫩及其氨基酸组成的基础上，探讨了饵料蛋白质水平对其卵巢发商过程中翳蒺骧瑟獒巢靛蛋鑫囊含量及氨基酸缀减熬影竣；在截餐孛华绒螫蟹藏熬拜巢卵黄磷蛋白抗体的前提下，研究了夤白质静养对成熟期卵巢卵黄磷蛋白合成的影酸；著对仔蟹麓静赘分必豢 氢基骏逶室霉簧量，鬃鑫震秘维生素魏兹辍曩 擘爰进行了研究。此外，还研究了蛋白质营养对中华绒螫蟹卵巢发育期和仔蟹生长期淡化酶豹影嗡
9、，以翘为孛肇绒螯蟹熬生殖慧莠生骥磷究积累基礁瓷鹳，冠慰迄荛人工育苗生产过程中的规范亲体培育及全价配合饲料的研制提供理论依据。一、中华绒螯蟹卵黄磷蛋白的分离、纯化与鉴定茸前夜判定虾籍卵巢成熟和卵质时，大多采用性腺指数、蛋白质和脂类的组成与含量等生化搬标，尚不够全露。本研究试图建立一种有效的免疫检测手段来测定卵巢中卵黄磷蛋白含爨，以较为直接地反映卵巢成熟稷度及卵细胞质髓的优劣，这要求先获褥纯化的卵黄磷篓自，供制各抗体之用。魍此，运用S e p h a d e xG - 2 0 0 凝胶层析法( g e lc h r o m a t o g r a p h y ) 从中华绒澄蟹的成熟卵巢中分离、纯化
10、得到一种缀自复合物，经聚丙烯酸胺梯度凝胶电泳( P A G E ) 确定其纯度；该蛋白复合体可被苏丹黑( S u d a nb l a c k ) ，S t a i n 。a l l 和S c h i f f 试帮染色，表明其含有脂类、糖类积磷等组分，由此可以确宠该蛋自复合物即是卵黄磷蛋白( 1 i p o v i t e l l i n ) 。又经S D S - 聚丙烯酰胺梯魔凝胶电泳( S D S P A G E ) 分析发现，卵黄磷蛋自分子量为5 2 0 8 5 土1 9 0 2k D a ，并幽分子爨分别为9 6 9 2 + 2 8 3k D a 和7 3 8 6 1 。8 9k D
11、a 的两种亚基缀成。对纯化卵黄磷蛋自的氨基黢组成和含量也避行了分析，发现必需氨基酸总擞占5 1 。3 0 ，略高于非必需氮基酸；其中，谷氨酸( G l u ) 和天门冬氨酸( A s p ) 含量较商，分剐这1 0 。8 0 和1 4 3 1 ：壳氨酸( L e u ) 、赖氨酸( L y s ) 、精氨酸( A r g ) 和缬氨酸( V a l ) 次之，含量分别为9 4 3 、7 8 3 、7 0 8 和6 8 8：面牛磷酸( T a u ) 、半髋氨酸( C y s ) 释蛋氨酸( M e t ) 含量较低，百分含量分别为0 1 7 、1 0 1 和1 4 0 。分析中华绒螯蟹卵黄磷蛋
12、白的氨基酸组成及含量霹为其采体除敷翡必需熬基酸营养需求撵供标溱参考。二、中华绒螯蟹弗巢成熟麓蛋自蕊和弗黄磷蛋自岔：交讹的研究探讨卵巢成熟过程中卵黄磷蛋融合成和积累的规律，对于深入研究亲黧的生殖营养至关重要。于2 0 0 1 年8 1 2 月自上海市郊淀山湖取中华绒螫蟹雌体亲蟹。在采蔫纯纯翡舞黄磷蛋自受疫兔蔼获得英筑体的基磊蠡上，运用酶联免疫吸附硷测- - 2 - -中文摘婴中 绒整赞盘 质霈荐生理研究滚( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，E L I S A ) 分褥测定了郛聚筏熬过程孛舞巢内卵黄磷蛋白含量。结
13、果表明，随着卵巢成熟度的增加，卵黄磷蛋白含蓬由从篱l l 鲻鹃0 , 2 2 m g 箨檠增援楚第群麓懿3 6 0 3I m g 嚣檠，萁麓主舞幅度最隽显藩鹄是从第1 I 期发育至第1 I I l 期，达1 0 3 4 9m 卵巢；卵巢内总蛋囱含量变化亦呈现相同熬趋势，第l l 麓黟含量为3 9 t 5m 雾囊，l 嚣第簇瓣蛋囊含量为第l l 鬟l O 倍左右；性腺指数( g o n a d o s o m a t i c i n d e x ，G S I ) 与卵黄磷蛋白的相关方程为Y ；4 5 9 2 3 x- - 4 8 1 9 8 O 。0 5 ) ：自第1 I I I 期发育至第期的
14、过程中。卵巢中蛋白质和卵黄磷蛋白含艟在不同蛋白饲料组之蝴均存在晨著性麓异( P 0 0 5 ) ：卵黄磷蛋白含量以4 5 蛋白饲料组为最高，达3 2 7 。3 4 m g 雾黎，显著毫予3 5 拳I2 5 鬃鑫镶辩缀 0 0 5 ) ；饲料蛋白质水平对卵巢成熟期肝簇黥孛G 鞭穗G O T 酶添瞧其毒最著蛙影国( 含壤在不周疆自饲料组闻存在显著燃差异( P 0 0 5 ) ：蜕皮频率以2 0 饲料组和2 4 饲料组较高，分别为2 4 和2 3 5 ，且较其余四个饲料组间具有显著性差异( P 0 0 5 ) ，但与1 6 5和3 1 5 二个饲料组间存在显著性差异( P 0 0 5 ) ，但就相同
15、蛋白质水平而言，维生素B 6 的影响达到了显著差异水平( P 0 0 5 ) 。六、饵料鬣自质和脂类对中华绒薇蟹性成熟勰消化酶活性的影响采用不同蛋白质水平( 3 5 和2 5 ) 和脂肪水平( 1 2 和9 ) 的四组实验饲粳，以鲜活疆料 乍对照，探落锤糖蛋自震秘l 器黪对孛华绒螫蟹劈巢残熬过程中消化酶活性的影响。结果袭明：( 1 ) 随着卵巢的不断发育，鲜活饵料组胰谮白酶( t r y p s i n ) 滋牲扶第j 期载0 4 9 5U m g 逐灏上舟，待爵至簿疆2 朔戆0 。6 6 8 U m g后即趋稳定；不同脂肪含麓的两个3 5 蛋白饲料缀在卵巢发育过程中胰鬣白酶活性总薅黧上升的趋
16、势，蕊2 5 蛋自键辩缓簇蛋癌酶活瞧在羚巢发育的灏个时期却呈轻微的下降；比较卵巢发育的第1 I 和I I I 期备饲料组之间胰骚白酶活性均未见有显蒜性差异( P 0 0 5 ) ，但在第l I l 2 期窝筹期，对照锤辩缎胰蛋鑫瓣活性明最高于2 5 蛋自饲料组( P O 。0 5 ) 。说翳适量的鼗自质对胰蛋白酶活性有促进作膊，而长时间蛋白质不足则会导敬胰蛋白酶活性下降，饵料蛋白成对酶活性豹影响具有明显的累积效应。( 2 ) 各实验饲料组的淀耪酶( a m y l a s e ) 活性随着卵巢的发育鞠成熟呈逐渐下降的趋势；卵巢发育的第1 I 期和第1 v 期，五个饵料组的淀粉酶活性均无驻著性差异( P O 0 5 ) ，蕊在第1 I I l 期和第1 1 1 2 期对照组显著高于圈个实验饲料组( P O ，0 5 ) 。上述研究结果说明中华绒螯蟹索体在鬣
