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1、胚培养和离体授粉,一、胚培养 （一）概念 1. 胚培养(Embryo Culture)将胚从胚珠或种子中取出，置于适宜的培养基生长；包括未成熟胚和成熟胚以及杂种胚的离体培养 2. 胚挽救(Embryo Rescue)由于营养或生理原因造成难以播种成苗或在发育早期阶段就败育或退化的胚进行早期离体培养,（二）胚培养的意义1. 胚挽救：远缘杂交合子胚发育不良，中途败育，胚培养可获得杂种植株。2. 打破种子休眠：提高萌发成苗，缩短育种周期，加速良种繁育。3. 诱导次生胚状体及胚性愈伤组织。4. 种子生活力快速测定：木本植物种子后熟期长。,（三）离体胚的发育方式1. 合子胚发育途径：球形胚-心形胚-鱼雷
2、胚-子叶胚2. 脱分化形成愈伤组织，可分化出胚状体或不定芽。3. 早熟萌发，形成生活力很差的畸形苗早熟萌发(early mature sprouting): 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗， 通常称之为早熟萌发。,胚发育可分为异养和自养两个阶段。异养阶段:在此阶段,胚主要依靠胚乳及周围的母体组织吸取养分.自养阶段:开始于心形胚后期，此时，胚在代谢上已能由基本的无机盐和糖合成生长所需要的物质.。,三、培养方法 1. 成熟胚培养 （1）外植体果实或种子，进行表面消毒，然后剥离胚 A. 胚珠的培养将果实洗净，在超净工作台上，进行消毒,先用70%酒精消毒,用无菌水冲洗3
3、次,再用0.1%升汞消毒,无菌水冲洗3次,从果实中取出胚珠,放入三角瓶中培养.,B. 胚珠横切培养胚珠横切处理后，胚成苗速度也较快接种天后胚芽从切口处萌发出两半白色子叶，并迅速长大转绿，而后由珠孔端长出根茎,叶,根同时生长，幼苗健壮而接种裸胚天后虽能萌发，但后期生长缓慢，幼苗生长细弱,取材,消毒及剥离胚,胚发育阶段,成苗,炼 苗,移 栽,2. 原胚培养原胚指未成熟的胚，一般胚龄越大，成功率越高。 （1）基本培养基降低硝酸盐浓度，提高K+、Ca2+浓度，可促进胚生长蔗糖作为碳源，调节渗透压，胚龄越小，要求的渗透压（糖浓度）越高，可控制幼胚早熟萌发。一般为8%12%，随胚龄增长而降低。 （2） 生
4、长调节剂及附加物ABA与NH4+可以抑制早熟萌发，椰乳、胚乳提取物、番茄汁可促进幼胚生长。,二、离体授粉 （一）概念植物的离体授粉（in vitro pollination）也叫离体受精( in vitro fertilization)或试管授精( test tube fertilization)，是在人工控制条件下使离体的胚珠或子房完成授粉、受精形成种子的过程。植物的离体授粉技术一般包括胚珠试管授精、离体子房授粉和雌蕊离体授精三个方面。,（二）离体授粉的方法 1. 胚珠试管授精 （1）取胚珠 将欲培养的子房表面消毒，在无菌条件下将子房壁剥掉，除去花托，取出带胚座的裸露胚珠，接种在培养基上。
5、（2）人工授粉 在接种好的胚珠表面直接授以无菌的花粉，或者 预先培养花粉，然后把带有胚座的裸露胚珠，接种于花粉培养基上进行授粉。,2. 子房离体授粉通过人工的方法把花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发并完成受精作用，可以使得花粉管不经过柱头和花柱组织，直接进入子房中的胚珠，有可能克服孢子体型不亲和现象，从而获得远缘杂种。,（1）直接引入法用锋利的刀片在子房壁或子房顶端开个切口，把花粉悬浮液滴于切口处，或者 （2）注射法在子房顶端和子房基部切两个注射孔，用注射器吸取花粉悬液从基部注孔注入。当悬液从近子房端的注孔溢出时，表明子房腔内已充满花粉悬液。此时，用凡士林封闭两个注孔，将子房接种于培养基
6、上。,3. 雌蕊离体授粉在花粉尚未开裂时切取母本花蕾，消毒后在无菌条件下除去花瓣、雄蕊，保留萼片，将整个雌蕊接种于培养基上。在培养的当天或次日，在其柱头上授以无菌的父本花粉。,（三）影响离体授粉的因素 1. 外植体的发育阶段外植体发育时期不同，胚珠和子房的发育阶段不同。 2. 花粉粒数量及萌发力不同因子处理外植体以提高花粉萌发力。 3. 营养条件基本培养基的种类、激素的配比、渗透压、pH值等均会影响外植体的成活率，水解酪蛋白、B族维生素等对某些外植体也有良好作用。,4. 授粉方式不同材料、不同外植体类型要进行试验以确定最佳方式。 5. 保留母体组织的影响保留较多母体材料可使外植体少受伤，以减少无菌操作过程中存在的如消毒等因素的负面影响。 6. 基因型的影响不同基因型对离体授粉培养成功率有明显影响 。,
