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1、实验二 显微镜的使用和细菌形态与染色,一、实验目的,1学习、掌握油镜的使用； 2学习、掌握细菌涂片染色； 3学习、掌握细菌的革兰氏染色； 4建立“无菌操作”的概念，学习其技术。,二、实验原理1,显微镜的构造 1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等)。它使检视物放大,生成物象。,2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持 调节 固定等作用.,油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质
2、是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,根据公式D=/2nsin(/2 ) ，增大分母，使得D值减小，分辨率增大。,显微镜的放大倍数和分辨率1. 放大倍数：物镜放大倍数目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析两点之间距离的能力。可用公式表示为：D=/2nsin(/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。,D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗
3、布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,显微镜保养和使用中的注意事项,单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。,革兰氏染色,丹麦C.Gram创立，用于细菌
4、分类学研究 细菌细胞壁的结构,G肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。G细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。,三、实验材料,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（24h培养物）载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。革兰氏染色液一套,四、实验步骤,1细菌单染色：（1）分别制备标号为1、2及牙垢涂片并染色；（2）步骤：彻底清洗载玻片中心加半滴水无菌操作取菌涂布于水中（1cm2）干燥火焰固定染色（1min）水洗吸水凉干
5、观察记录图示/描述判定各菌,2、革兰氏（Gram）染色法,1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约1520秒，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。,五、实验结果,记录所观察到的三种菌革兰氏 染色结果的差别，判断是G/ G。绘图描述各菌形态。,六、问题与讨论,1使用高倍镜与油镜调焦时应注意什么？ 2革兰氏染色涂片为何不宜太浓厚？实验关键步骤？ 3对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确证你的结论正确？,本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！ 请第一组同学留下值日 下周再见！,
