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1、时间分辨免疫荧光技术,演讲人：李超,2015年2月3日,主要内容,目前有哪些标记免疫学分析方法？ 什么是免疫荧光技术？ 什么是时间分辨免疫荧光技术？ 时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？ 时间分辨免疫荧光技术可应用于哪些方面？,目前有哪些标记免疫学分析方法？,免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶联免疫分析 (Engvall, 1971) 胶体金标记免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland
2、, 1990) 生物芯片(美国Luminex公司, 1997),什么是免疫荧光技术？,基本原理：,免疫荧光技术是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位。,什么是时间分辨免疫荧光技术？,概念：,时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的
3、成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。,什么是时间分辨免疫荧光技术？,基本原理：,用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质； 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度； 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的,什么是时间分辨免疫荧光技术？,例如：,三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性
4、强 Stokes位移大寿命长的特点； 采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2 连接； 在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大。,通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来,时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？,精确度上的优势:,放射免疫 （精度：10-12mol/L） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L） 胶体金标记
5、（精度：10-15mol/L） 化学发光 （精度：10-15mol/L） 电化学发光 （精度：10-17mol/L） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L）,技术上的先进性,特点,特异性荧光与非特异性荧光分离度高,时间、光谱分辨,发射荧光与激发荧光分离度高,零背景、高特异性,解离、增强,荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物,线性范围更宽 重复性更好,标记位点,标记位点多 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小,高稳定性，高精确度 试剂保存时间长 标准曲线保留时间长,标记方法,单、双标记 多标记,同一试剂盒可同时测多个项目,时间分辨免疫荧光分析相
6、较于化学发光的优势,发光效率 重复检测 本底噪声 灵敏级数 标记物 标记位点 标准曲线 多标记 科研开发,时间分辨荧光,化学发光,95% 可无数次 零本底 10-18 原子 可达20个/抗体 稳定达一年以上 最多可达四标记 有,1% 不可重复 干扰大 10-15 大分子化合物 1个/抗体 稳定 2 到 4周 无 无,时间分辨荧光和电化学发光比较的优势,标记物 多标记技术 做科研 试剂种类 试剂价格,Eu, Sm, Te, Dy 有 能 58种临床,24种科研 低,钌 无 无 28种临床, 无科研试剂 高,时间分辨荧光,电化学发光,时间分辨免疫荧光技术优点总结,零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂
7、有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 对环境及人体没有任何影响,时间分辨免疫荧光技术的应用,内分泌检测,甲状腺功能检测,糖尿病指标检测,生长激素检测,T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、Ab 、TPO Ab,胰岛素、C肽,hGH（生长激素）,意义：,甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据 用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和用于胰岛素瘤的诊断 对诊断肢端肥大症是一项特异的方法,时间分辨免疫荧光技术的应用,妇产科检查： hCG 绒毛膜促性腺激素 LH-S
8、pec 黄体生成素(特异性) FSH 促卵泡激素 PRL 催乳素 E2 雌二醇 Testo 睾酮 Prog 孕酮 SHBG 性激素结合球蛋白,意义：,检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要的意义。,肿瘤科检查： AFP 甲胎蛋白 PSA 前列腺特异抗原 B2-M Beta 2微球蛋白 NSE 神经元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原 PSA Free/total 前列腺特异抗原/总量,时间分辨免疫荧光技术的应用,肿瘤标志物是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移及判断预后等。,意义：,时间分辨免疫荧光技术的应用,遗传疾病检查,产前筛查 新生儿筛查,血液疾病检查,贫血检查 白血病分型 免疫细胞分型 细胞毒试验,传染病检查,乙肝系列,表面抗原 表面抗体 e抗原 e抗体 核心抗体,意义：,预防患有严重遗传性疾病和先天畸形的胎儿出生 及早发现某些危害严重的先天性遗传代谢性疾病 为乙型肝炎临床早期诊断和治疗提供病原学依据,结束语,时间分辨免疫荧光技术作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。,感谢各位领导聆听！,THE END,演讲人：李超,
