《骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化影响因素的探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化影响因素的探讨（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的影响因素张永强 杨自权 卫小春 *山西医科大学第二临床医学院骨关节科 030001摘要：骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有成软骨能力，但影响其向软骨细胞分化的因素很多，如培养基条件，血清，培养方式，传代次数，接种密度，低氧，力学刺激，细胞因子，支架材料和基因修饰等。只有将这些影响因素优化组合，才能发挥 BMSCs 成软骨的最大效应。关键词：骨髓间充质干细胞；软骨细胞；培养基；血清；传代；密度；低氧；力学刺激；细胞因子；材料；基因修饰Abstract: Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) have the pot
2、ential of differentiating into cartilage. But there are many influential factors in their chondrogenic process , such as the medium conditions, serum, culture mode, passages, inoculation density, hypoxia, mechanical stimulation, cytokine, scaffold materials, genetic modification and so on. Only opti
3、mized combination of these factors can make more bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into chondrocytes better.Keywords: Bone marrow mesenchymal stem cells; chondrocytes; medium; serum; passages; density; hypoxia; mechanical stimulation; cytokine, scaffold ; genetic modification软骨组织工程的研究
4、发展为关节软骨损伤的修复带来了新的希望。骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能 1，已成为理想的种子细胞之一，也是目前软骨组织工程的研究热点。骨髓间充质干细胞在修复软骨损伤时，无论在体内体外，都必须经历向软骨细胞分化的过程，在此过程中有着诸多影响因素，目前在这方面的研究亦较多。现将影响骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的多方面因素进行综述。1 细胞培养1.1 分离方法从骨髓中分离骨髓间充质干细胞的方法主要有贴壁法 、密度梯度离心法 、免疫磁珠或流式细胞仪分离法 2。前两者因为简单有效所以应用较多。Wang 等 3应用贴壁法和密度梯度离心法分别培养BMSCs,并在同种条件下
5、向软骨细胞诱导分化，最后用免疫组织化学染色和原位杂交法鉴定两组型胶原及型胶原 mRNA 表达，结果显示两种方法分离的 BMSCs 均能成功的诱导分化为软骨细胞且无明显差别。但有研究表明：通过贴壁法培养的细胞在纯度、活性、生物学形态和特征、增殖传代能力方面更优于密度梯度离心法 4-5。1.2 培养基a-MEM、DMEM-LG 、DMEM-HG 、DMEM、DMEM-F12 是目前在 BMSCs 培养过程中应用较多的培养基。绝大多数实验室采用DMEM-LG 培养基进行 BMSCs 的分离与扩增 ，少数实验应用 DMEM-F12、a-MEM 、DMEM 、DMEM-HG 进行，因为低糖条件比高糖条件
6、更利于 BMSCs 的增殖 6。但 Majumdar 等 7比较了DMEM-LG，a-MEM 培养基对间充质干细胞生长的影响，认为 a-MEM 中培养的细胞较 DMEM-LG 具有更高的集落形成率和促增殖作用。然而，Coelho 等 8却发现 a-MEM 和 DMEM-HG 对人骨髓间充质干细胞的增殖能力没有明显的影响。大多实验室用 DMED-HG构成的完全诱导培养基诱导 BMSCs 成软骨分化。目前，国内外有关培养基对 BMSCs 向软骨细胞诱导分化影响的研究较少，还需进一步探讨。1.3 血清虽然无血清培养基在细胞培养中也有所应用，但因其添加的成分价格昂贵，体外培养操作复杂，不利于大规模产业
7、化生产，而在应用上受到了限制，所以血清在细胞培养过程中显得至关重要。Shahdadfar 等 9研究表明：自体血清和胎牛血清都有利于人 BMSCs增殖，胎牛血清更佳，两种血清对人 BMSCs 的形态和表型均无影响，但在分化水平上自体血清不如胎牛血清。同种异体人血清不利于 BMSCs 增殖，而且会导致细胞生长停滞以及死亡。刘一天等 10用含有不同浓度胎牛血清的诱导液对 BMSCs 向软骨细胞诱导分化，结果表明浓度为 10%的胎牛血清有利于 BMSCs 向软骨细胞分化。血清中除了含有已知的白蛋白、脂类、维生素、糖类等物质外，血清中还含有一千余种未知的化学成分，这些已知和未知的血清成分均有可能对 B
8、MSCs 的成软骨分化和组织形成产生重要的影响 11。但具体是哪些成分对 BMSCs 向软骨细胞分化有促进作用及其具体机制如何，这些问题还有待研究。1.4 培养方法目前，很多实验室培养 BMSCs 都是应用平面培养瓶二维静态培养，但研究表明在促进 BMSCs 向软骨细胞分化方面三维培养环境优于二维环境，动态培养优于静态培养 12-13。Johnstone 等 14于1998 年首先提出了三维培养体系，将 BMSCs 制成高密度细胞微球，在这种三维培养体系中，成功地使 BMSCs 分化为软骨细胞。PITTENGER 等 15通过离心使 BMSCs 形成小的团状沉淀，然后静置培养，10-14 d
9、后，细胞形态由梭形变为肥大软骨细胞状，表达软骨细胞的特异分子标记物型胶原及胞外基质中蛋白聚糖丰富。并且，随着培养时间的推移，具有软骨细胞分子标记物的细胞数量越来越多。培养 3 个月， 通过组织学观察可见软骨细胞样陷凹。将三维支架材料与细胞复合培养也是给细胞提供一个三维培养环境。三维培养环境将细胞外基质良好的固定与细胞周围，有利于细胞外基质发挥对细胞增殖分化及代谢的调节作用 16。动态培养采用生物反应器，目前应用较多的生物反应器主要为微重力旋转生物反应器和流体灌注式生物反应器。微重力旋转生物反应器是模拟细胞生存的体内微重力环境，使细胞承受较低的剪切力，提高细胞内外、细胞间物质传递效率，从而提高细
10、胞分化质量 17。王会才等 12研究表明：微重力条件下动态诱导 BMSCs 细胞外基质成分胶原和蛋白多糖产量均高于非微重力组，三维动态培养组效果最佳，提高了软骨细胞分化的质量和效率。流体灌注式生物反应器是模拟软骨细胞在体内的间歇性生理液态压力条件。Carver 等 18发现在间歇性生理液态压力下，于 PGA 网上培养 5 周的马的软骨细胞，可明显促进细胞外基质的合成，其糖胺多糖的含量至少是无压力培养组的两倍，并与液态压力的压缩模量有量效关系。1.5 传代次数目前，国内外有关传代对 BMSCs 向软骨细胞诱导分化影响的研究尚少。Banfi 19等研究表明 BMSCs 在传至第 4 代时成软骨能力
11、即开始降低，24 次倍增后成软骨能力丧失。但胡静波等 20表明将人BMSCs 进行 24 次倍增后倍增能力丧失，但成软骨能力人保留。霍建忠等 21将不同代 BMSCs 经成软骨诱导后， RT-PCR 检测蛋白多糖 mRNA 表达及甲苯胺蓝染色，结果显示第 6 代后 BMSCs 成软骨能力减弱。建议 BMSCs 作为软骨组织工程种子细胞应选择第3、4、5 代行成软骨诱导。1.6 细胞接种密度胚胎发育过程中体内软骨形成的最早形态学变化是间充质细胞间距缩小，细胞与细胞之间形成紧密接触状 22。细胞局部聚集是软骨形态发生前的重要步骤。这种细胞的局部聚集被认为是由细胞与细胞之间的粘附分子或细胞外基质成分
12、如纤维粘连蛋白，层粘连蛋白所介导，并可以被细胞间粘附分子钙粘素所加强 23。上文提到的能诱导分化为软骨细胞的细胞微球和离心沉淀形成的细胞团都是给BMSCs 生长提供一个高密度三维生长环境，这种环境有利于细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间的信号传递，类似于胚胎发育过程中软骨形态发生前间充质细胞聚集。研究表明，接种密度大于1106cm 2 能促进 BMSCs 分化为软骨细胞，而且能使细胞外基质在一定时间内迅速形成 24。Ponticiello 25等将人 BMSCs 以不同密度接种于明胶海绵，在含 TGF- 3 的化学限定培养基中培养，结果表明细胞的接种密度影响细胞产生糖胺多糖和型胶原的能力，以
13、12106 个ml 的密度最为有效。2 物理因素2.1 低氧环境大量研究表明低氧环境有利于 BMSCs 向软骨细胞分化。MOUSSAVI-HARAMI 等 26通过观察体积分数 0 .21、0.05 两种氧分压下的软骨细胞和间充质干细胞的培养发现， 在体积分数 0 .21 氧分压下的软骨细胞和间充质干细胞的增殖受到严重的削弱，并且氧化产物大量堆积。Ohnishi 等 27研究发现低氧促进了 BMSCs 增殖因子的基因表达，如结缔组织生长因子、 成纤维细胞生长因子 7、血小板源性生长因子 A。而且发现在短时间内这些因子表达水平与低氧培养时间成正相关。Robins 等 28研究表明，低氧条件下培养
14、BMSCs，软骨细胞标记物 Sox-9 基因表达明显增加，说明低氧促进BMSCs 向软骨细胞分化。Martin-Rendon 等 29在低氧条件下培养BMSCs 24 小时后发现短时间的低氧环境有利于 BMSCs 的增殖和向软骨分化。Grayson 等 30将 BMSCs 在三维环境下进行长时间低氧培养，发现体积分数为 2%的低氧刺激能增强 BMSCs 的增殖和向软骨细胞分化。关节腔内环境是一种低氧的环境，在体外低氧环境下诱导培养的 BMSCs 能向软骨细胞分化，可能正是因为这种低氧环境近似于关节腔环境。2.2 力学刺激研究发现适当的力学刺激对 BMSCs 向软骨细胞分化有一定的积极作用。上文
15、也提到生物反应器产生的微重力环境和流体灌注压能促进 BMSCs 分化为软骨细胞。刘天一等 31将猪 BMSCs 在离心机中培养，2 次/天，每次 30min，结果发现微重力能诱导 BMSCs 向软骨细胞分化，并形成软骨陷窝样结构。吕昌伟等 32将 BMSCs 放置在 12r min 的旋转培养箱中培养，结果发现微重力能够显著促进成软骨分化，同时也提高了 II 型胶原以及蛋白多糖等软骨特异性基质的沉积。Angele 等 33在循环流体静压力刺激条件下培养BMSCs，2w 和 4w 后发现，蛋白多糖和 II 型胶原在基因水平和蛋白质水平上都显著提高，表明细胞向软骨细胞分化。并应用单纯的力学刺激诱导
16、部分 BMSCs 分化为软骨细胞。证明了单一的力学因素可以促进 BMSCs 向软骨细胞分化。Mouw 等 34研究表明力学刺激可以促进 TGF-1 的信号传导，而 TGF-1 能提高 BMSCs 对力学刺激的敏感性，进而促进成软骨分化。虽然单一的力学刺激能诱导部分BMSCs 成软骨分化，但力学刺激与转化生长因子等协同作用能更好地促进 BMSCs 分化为软骨细胞。3 支架材料和细胞因子组织工程的三大要素即：种子细胞，支架材料和细胞因子。在以BMSCs 为种子细胞的软骨组织工程中，选择对 BMSCs 生长增殖及向软骨细胞分化有积极作用的的支架材料和细胞因子非常重要。3.1 细胞因子目前研究最多的促进 BMSC 成软骨分化的细胞因子主要有转化生长因子-（TGF-） 、骨形态发生蛋白（BMP） 、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和胰岛素样生长因子(IGF)
