作物分子育种

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1、一、作物分子育种一、作物分子育种 作物育种基本任务作物育种基本任务：1.在研究和掌握作物形状遗传变异规律的基础上， 发掘研究和利用作物种植资源；2.选育优良品种或杂种以及新作物；3.繁 殖生产用种。 作物分子育种作物分子育种：即在经典遗传学和分子生物学等理论指导下，将现代生 物技术手段整合于传统育种方法中，实现表现型和基因型选择的有机结 合，培育优良新品种。 分子标记育种分子标记育种：又称为分子标记辅助选择，是利用与目标基因紧密连锁 的分子标记，在杂交后代中准确鉴别不同个体基因型，从而进行辅助选 择育种。特点特点：能有效结合基因型与表现型鉴定，显著提高选择的准确 性。 转基因育种转基因育种：利

2、用基因重组 DNA 技术，将功能明确的基因通过遗传转 化手段导入受体品种的基因组，并使其表达期望形状的育种方法。特点特点： 能打破基因不同物种交流障碍，克服传统育种的困难问题。 分子设计育种（刚起步）分子设计育种（刚起步）：目的通过各种技术的集成与整合，在育 种家的田间试验之前，对育种程序中的各种因素进行模拟、筛选和优化， 确立目标基因型，提出最佳亲本选配和后代选择策略，提高育种试验可 见性。 我国作物分子育种中存在的问题我国作物分子育种中存在的问题：1.基因资源挖掘力度有待加强；2.实用 分子标记和具重要育种价值的基因十分贫乏；3.作物分子育种技术尚待 突破；4.通过分子育种培育的突破性品种

3、不多，产业化程度不高；5.作物 分子育种的组织体系和实施机制需要创新。 作物分子育种意义作物分子育种意义：1.发展作物分子育种是保障国家安全的重大需求；2. 全面实现作物分子育种相关技术突破；3.加速作物分子育种研发和产业 化。 常规育种和分子育种比较常规育种和分子育种比较：1.常规育种表现型选择时，会受时空因素影 响，而分子育种不会；2.常规育种来源广，育种亲本贫乏；分子育种基 因来源广，基因资源丰富。3.常规育种基因局限于种内，少数局限于亚 种间；分子育种基因交流不受物种限制。4.常规育种目标性状有不明确 性；分子育种目的基因功能已知，目标性状明确。5.最明显特征最明显特征：常规 育种选择

4、时间长；分子育种选择时间短，可调控基因及其产物的功能、 表达。 分子育种与传统育种关系分子育种与传统育种关系：分是传的延伸和发展，二者是互补、嫁接、 结合的关系，常规育种与分子育种形成了现代作物育种。二、作物分子标记育种二、作物分子标记育种 遗传标记遗传标记：指可追踪染色体，染色体某一节段，某个基因座在家系中传 递的任何一种遗传特性。两个特点两个特点：可遗传性、可识别性。 在植物遗传育种研究中可被应用的遗传标记应具备以下四个条件在植物遗传育种研究中可被应用的遗传标记应具备以下四个条件：1.多 态性高；2.最好表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型；3. 对主要农艺性状影响小；4.经济方

5、便，容易观察记载。 植物中常用的遗传标记：植物中常用的遗传标记： 形态学标记：形态学标记：即植物的外部形态特征，主要包括肉眼可见的外部特征， 如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫 性等有关的一些特性。 细胞学标记细胞学标记：即植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、 结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C 带、N 带、G 带等）的变 化。 生化标记生化标记：利用电泳技术对蛋白质、酶等生物大分子进行鉴定。主要包 括同工酶和等位酶标记。 分子标记分子标记 分子标记的类型：分子标记的类型：RFLP、RAPD、AFLP、SSR 分子标记：分子标记：在生物系统和进化

6、研究中，每个能反应遗传变异的，能提供 系统学信息的多态位点称为一个分子标记，在遗传育种研究中每个与感 兴趣的性状或目的基因链锁的多态性位点也称为一个分子标记。特点特点：1.表 现稳定（DNA 形式） ；2.数量多；3.多态性高；4.表现中性，不影响目标 性状表达；5.区别 Aa 和 AA；6.成本不太高。 分子标记技术分子标记技术：能提供分子标记的分子生物学技术。特点（优点）特点（优点）：1. 分子标记技术选用的分子信息比较稳定；2.提供遗传信息量是无限的；3. 能很好区分同源性和相似性；4.能提供物种间比较共同的尺度；5.打开了 遗传学研究的大门。三、三、DNA PEX（异基磺原甲酸）提取方

7、法的具体步骤包括（异基磺原甲酸）提取方法的具体步骤包括：1.研磨研磨：加入液氮研 磨后，放入液氮预冷的离心管，尽量用 2ml 管，研碎材料不超过离心管 一半；2.水浴水浴：加 800ul 的 PEX 提取液，充分混匀，65水浴 45 分钟， 期间混匀 3 次，动作不能剧烈；3.离心离心：12000rpm 室温离心 10 分钟，取灭过菌管，将上清液转入，再次离心；4.沉淀沉淀 DNA：离心后上清液再 次转移，在装有转入上清液的离心管中加 1/10 体积的 3mol/l 醋酸钠和 1 倍体积的异丙醇，混匀，放入-20的冰箱中至少沉淀 30 分钟；5.洗洗 DNA：离心 15 分钟，倒掉上清液，70

8、%酒精洗所得的 DNA，分两次进 行；6.室温干燥室温干燥：用适量的 TE 溶解 DNA；7.再次离心：再次离心：DNA 中的杂质 和不溶物会沉于离心管底部，将上清转移到 5ml 的离心管中，管壁标记 材料名称；8.检测检测 DNA 质量及浓度，放入冰箱。 DNA 提取注意事项提取注意事项：1.提取材料尽量要幼嫩叶片；2.整个提取过程应低 温，一般利用液氮、冰浴；3.当 DNA 处于溶解状态，尽量减弱溶液涡旋， 动作要柔缓。 DNA 降解的外源因素降解的外源因素：1.外界物理因素：温度、湿度；2.化学因素：PH 值、水解反应、氧化反应；3.生物因素：酶解及微生物侵染等作用。这 些因素都直接与

9、DNA 的构型分子组成有关。四、植物四、植物 DNA 的分子和检测的分子和检测 在琼脂糖凝胶电泳中影响在琼脂糖凝胶电泳中影响 DNA 迁移的因素迁移的因素：DNA 分子质量、DNA 分子 构型、琼脂糖、凝胶浓度、电场强度、EB 影响。 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳板的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳板的制备：清洗电泳板处理电泳板组装 电泳板电泳板灌胶。电泳板灌胶是最关键的一步。 影响泳动速度的因素影响泳动速度的因素：电场强度缓冲溶液的 PH缓冲溶液的离子 强度电渗焦耳热筛孔五、五、RAPD 标记标记 RAPD 标记技术的实验原理标记技术的实验原理： RAPD 标记技术的应用标记技术的应用：RAPD 标记可

10、用于植物亲缘关系及种质资源 遗传多样性分析RAPD 标记构建分子标记遗传连锁图谱对优异基因 定位及优异性状的选择构建 DNA 指纹图谱及品种鉴定鉴定及标记 外援染色体片段分子标记辅助育种 RAPD 标记技术的特点标记技术的特点：1.优点优点：RAPD 标记技术中使用的随机引物， 不需要预先了解目的基因和相应的序列，引物价格便宜，成本较低； RAPD 标记技术操作技术简单，试验周期短、能在较短时间筛选大量 样品选用引物没有种属限制需要模板量较少无需借助于有伤害性 的同位素，耗费的人力物力少灵敏度高可以覆盖整个基因组 RAPD 产物有大于 50%的条带扩增于单拷贝区。2.缺点缺点：用于二倍 体生物

11、时，不能很好的区别杂合子和纯合子在某种情况下，实验重复 性不高，实验结果可靠性低使用效果受生物种类的影响 如何简单设计一个实验，运用 RAPD 标记分析植物间的遗传多样性？六、六、SSR 标记标记 SSR 标记技术实验原理标记技术实验原理：SSR 即简单重复序列，又称微卫星 DNA，根 据微卫星 DNA 两端的单拷贝序列设计一堆特异引物，利用 PCR 技术， 扩增每个位点的微卫星序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一 般的，同一类微卫星 DNA 可分布于整个基因组的不同位置上，而通过 其重复的次数不同以及重复程度的不完全而造成每个座位的多态性。 SSR 标记的多态性丰富，重复性好，其标记呈

12、共显性，且在基因组中分 散分布，因此可作为遗传标记。 SSR 标记技术的应用标记技术的应用：SSR 标记技术已被广泛用于遗传图谱构建，品种 指纹图谱绘制及品种纯度检测，以及目标性状基因标记等领域。特别在 人类和哺乳动物的分子连锁图谱中，微卫星标记已成为取代 RFLP 标记 的第二代分子标记。 SSR 标记技术特点标记技术特点：1.优点优点：数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多 态性高具有多等位基因的特性，提供的信息量高以孟德尔方式遗传， 呈共显性，可鉴别出杂合子和纯合子每个位点由设计的引物顺序决定 结果重复性高，稳定可靠DNA 用量少，对 DNA 质量要求不高，操 作简单SSR 标记一般检测到的

13、是一个单一的多等位基因位点SRR 序 列的两侧序列常较保守，在同种而不同遗传型间多相同需要事先知道 重复序列两侧的 DNA 序列的信息来设计引物，因此引物开发成本高， 但一旦开发，同行受益无穷。2.缺点缺点：开发和合成新的 SRR 引物投入 高、难度大现有的 SSR 标记数量有限，不能标记所有的功能基因，不 能构建饱和的 SRR 遗传图谱SSR 多态性的检测和应用很大程度上依赖 PCR 扩增的效果SSR 座位突变率高，对变异反应非常敏感等。 SSR 标记如何设计引物标记如何设计引物：建立基因组 DNA 的质粒文库根据欲得到 的 SRR 类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克

14、隆对阳性克隆 DNA 插入序列测序根据 SSR 两侧序列设计并合成引 物以待研究的植物 DNA 为模板，用合成的引物进行 PCR 扩增反应 高浓度琼脂糖凝胶，非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。七、七、AFLP AFLP 标记技术的原理标记技术的原理：AFLP 技术是基于 PCR 反应的一种选择性扩增 限制性片段的方法。由于不同物种的基因组 DNA 大小不同，基因组 DNA 经限制性内切酶完全消化后，在限制性片段两端连接上人工接头作 为扩增的模板。实际的引物与接头和酶切位点互补，并在 3加上 23 个 选择性碱基，因此在基因组被酶切后的无数片段中，只有一小部分限制 性片段被扩增，即只有

15、那些与引物 3端互补的片段才能进行扩增，称为 选择性扩增。为了对扩增片段的大小进行灵活的调节，一般采用两个限 制性内切酶。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 可产生数量丰富的带型标记，然后根据凝胶上 DNA 指纹的有无来检测 多态性。分辨率高，是一种十分理想和高效的遗传标记。 所用的两种酶所用的两种酶：酶切频率较高的限制性酶，酶切频率较低的稀有酶； （4 个识别位点的 Mse I,6 个识别位点的 EcoR I） AFLP 引物包括引物包括 3 部分部分：5端的与人工接头序列互补的核心序列，限制 性内切酶特定序列和 3端的选择性碱基。 AFLP 的应用的应用：可用于构建分子遗

16、传连锁图谱可用于构建指纹图谱， 进行品种鉴定可用于种内和种间的遗传多样性研究可用于分子标记 辅助选择育种可用于基因定位基因克隆的研究。 AFLP 标记技术特点标记技术特点;1.优点优点：AFLP 不需要预先知道 DNA 序列的信息， 因此可以用于没有任何分子生物学研究基础的物种，概括其特点如下： 用于 AFLP 分析的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和种类很多 AFLP 多态性远远超过其他分子标记多数表现孟德尔方式遗传模 板用量少，且对模板浓度的变化不敏感AFLP 标记中由于扩增片段较 短，其分辨率很高由于利用特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性 低，可靠性高AFLP 分析的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对 应，可用于分析基因组 DNA 及克隆相应的 DNA 片段，可作为遗传图谱 和物理图谱的位标和联系两者的桥梁。2.缺点缺点：AFLP 标记技术试验中 对样品 DNA 的质量要求较高内切酶质量要求比较高技术难度高， 成本比较昂贵很难鉴别等位