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1、NBT法测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)活力 植物组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定,背景知识,植物在逆境胁迫或衰老过程中发生一系列生理生化变化: 如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调、活性氧的积累等。生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O2.-)、羟自由基(OH)、过氧自由基(ROO)、烷氧自由基(RO)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O21)等。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。,植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统：酶
2、促防御系统: SOD、CAT、POD和APX等非酶促抗氧化剂: ASA和GSH等 丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。,背景知识,实验目的 实验原理 实验材料与设备 实验步骤 注意事项 结果比较分析 思考题,NBT法测定SOD活力,实验目的 了解胁迫反应的具体机制（膜脂过氧化 & 抗氧化） 了解抗氧化防护酶的测定方法，掌握NBT法测定SOD活力,实验原理,SOD催化下列反应： 2O2.-+2H+H2O2+
3、O2 本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。光 SOD H2O2 核黄素+甲硫氨酸 O2.- + NBT 甲腙（560nm） 光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 SOD酶量与光化还原抑制百分率在一定范围内呈线型关系，一般以引起50光化还原抑制率的酶量为一个酶活力单位,材料、仪器设备及试剂 植物生理生化实验 p172-173,（一）材料与处理：小麦幼苗（盐处理与否）叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进 样器；4.荧光灯；5.试管数支。 （三）试剂： 0.05 mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH7.8）1
4、95 mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液1.125 mmol/L 氮蓝四唑NBT溶液100 umol/L EDTA溶液60 umol/L 核黄素溶液,实验步骤,1. 酶液提取：取1 g材料（CK & 盐处理）于预冷的研钵中，加5 ml预冷PBS磷酸缓冲液在冰浴研磨成浆，3000 g(4) 离心15 min，上清液即为SOD粗酶液。 2. 显色反应：取5ml试管4支，2支为测定管，另2支为对照管。反应体系中各试剂的终浓度为130 mmol/L Met，75 mol/L NBT， 4 mol/L 核黄素， 100 nmol/L EDTA，按下列次序及量（ml）加入各溶液：1 CK 2 盐处理 3
5、 4 暗管磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1酶液 0.1 酶液 0.1 缓冲液 0.1 缓冲液 0.1NBT溶液 0.2 NBT溶液 0.2 NBT溶液 0.2 NBT溶液 0.23. 测定 混匀后将2支试管（不加酶液而用缓冲液，为最大还原管）设为对照，其中1支对照管置于暗处，其它3支置4000Lux光（或阳光）下反应20min（显蓝色
6、），反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定2支试管的OD560,SOD活性计算,SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。(AckAE)VAck0.5WVtAck照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）,SOD总活性(U/g),POD活性测定 愈创木酚法,3 ml反应混合液 1 ml 50 mmol/L PBS 1 ml 0.2% H2O2 0.95 ml 0.18 mol/L愈创木酚（pH7.0） 50 l酶液，测定3 min内OD470 nm下的吸光值变化。立即开始计时，在470nm波
7、长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。 计算 以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/gFW）。,CAT活性测定,3 ml反应体系 0.2% H2O2 1 ml 50 mM PBS 1.95 ml 加入酶液 50 l 启动反应，记录240 nm下3 min内吸光值的变化.在240nm下每30秒读取一次OD值，共测3min。,酶活性强度以每分钟内OD240变化0.01为一个CAT酶活力单位，表示为U，以U/毫克鲜重（U/ mgDW） 按照以下公式计算： CAT活性=OD240*D/（0.01*FW*1
8、000）（U/ mgFW） OD240为一分钟吸光度变化值，FW为叶片鲜重，D为稀释倍数。 Vt粗酶提取液总体积ml； Va测定用粗酶液体积ml,植物组织中MDA含量的测定,实验目的了解胁迫反应的具体机制（膜脂过氧化 & 抗氧化） 掌握膜脂过氧化作用产物MDA含量的测定方法,丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统：酶促防御系统: SOD、CAT、POD和APX等非
9、酶促抗氧化剂: ASA和GSH等,背景知识,实验原理,测定植物体内MDA含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的MDA产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑2、4二酮），该物质在532nm波长下有最大吸收峰。 测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。因此测定植物组织中MDA与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。 此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。 在MDA含量测定时，同时测定600n
10、m下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。,双组分分光光度计法计算MDA,已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40、 7.40。 MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸系数为155， 600nm波长处有最小光吸收 532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。 根据双组分分光度计法建立方程组 D450=（85.4103）C1 （D532D600）=（155103）C2+（7.4103）C1 求解方程得式中 可溶性糖浓度 C11171D450 M
11、DA浓度 C26.45(D532-D600)-0.56D450,材料、仪器设备及试剂,（一）材料: 小麦幼苗（盐处理与否）叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进 样器；4. 试管数支。 （三）试剂: 5三氯乙酸(TCA)溶液0.67硫代巴比妥酸TBA溶液,实验步骤,1. 丙二醛的提取: 取植物叶片0.5g，加入少量石英砂和5三氯乙酸TCA 5ml，研磨至匀浆，3000 g离心10min，其上清液为MDA提取液。 2. 显色反应及测定取MDA上清液2ml，然后再加入2ml 0.67TBA。摇匀，混合液在沸水浴中反应30 min，冷却后再3000 g离心10min。取
12、上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。空白？,注意事项,取样适量（1215片叶/ 0.5g) 研磨成浆（豆腐脑） SOD反应体系依次加液 严禁枪头混用 最大还原管 & 测定空白管不照光的对照管 不照光的对照管置于柜子里 4000Lux光（或阳光）下20min（明显呈蓝色） 离心前严格配平（1） MDA测532、600和450nm三个值 严格使用说明正确使用分光光度计（更换波长后要调0）,MDA含量计算,MDA含量C (umol/L)6.45(A532-A600)-0.56A450A450、A532、A600分别代表450nm、532nm、600nm波长下的吸光值MDA
13、含量（nmol/gFW）CV上清 / gFW,思考题,SOD实验为何设置2支对照管？他们有何区别？如果可溶性糖含量影响MDA含量的测定，怎样消除其影响？,参考文献,王学奎植物生理生化实验原理和技术北京：高等教育出版社，2006 5Mingyi Jiang and Jianhua Zhang. Involvement of plasma-membrane NADPH oxidase in abscisic acid- and water stress-induced antioxidant defense in leaves of maize seedlings. Planta, 2002, 2
14、15: 10221030,双组分分光光度计法计算MDA,据朗伯一比尔定律：DkCL，当液层厚度为1cm时，D=kC， k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。 已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40、 7.40。 MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸系数为155， 600nm波长处有最小光吸收 532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。 根据双组分分光度计法建立方程组，A450=（85.4103）C1（A532A600）=（155103）C2+（7.4103）C1 求解方程得式中 C11171D450 C26.45(D532-D600)-0.56D450 C1-可溶性糖的浓度(mmolL-1) C2-MDA的浓度（umolL-1） D450、0532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。,Planta, 2002, 215: 1022,
