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1、临床病毒学检验,第一节 病毒的形态结构,体积微小，结构简单，非细胞型微生物 只含一种核酸 在活细胞内寄生 以复制方式进行增殖 对抗生素不敏感，干扰素可抑制其增殖；,葡萄球菌 (1000nm）,牛痘病毒 300250nm,A,B,C,D,E,F,G,立克次体 450nm,衣原体 390nm,A、大肠杆菌噬菌体( 65 95nm ),B、腺病毒(70nm ),D、乙脑病毒( 40nm ),E、蛋白分子(10nm ),F、流感病毒( 100nm ),G、烟草花叶病毒,C、脊髓灰质炎病毒(30nm ),形态,球形 杆形 子弹状 砖块状 蝌蚪状,病毒体结构模式图,壳粒,衣壳,核心（核样物）,核衣壳,包膜
2、,包膜病毒,包膜子粒,吸附,穿入,脱壳,生物合成,释放,组装成熟,病毒没有正常的细胞结构，缺乏一些与代谢有关的酶，单独不能复制，必须在活细胞内增殖,第二节 病毒的增殖,裸露病毒：胞饮作用,不同病毒，穿入方式不同,包膜病毒：包膜与细胞膜融合,噬菌体：注入式,病毒的配体位点与细胞表面的特异受体结合,三、脱壳,不同病毒脱壳方式不同多数病毒在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳,四、生物合成,宿主细胞内进行的，在病毒基因控制下的病毒核酸和蛋白质的合成过程,先合成一些复制酶、 抑制蛋白，抑制 宿主细胞的正常 代谢，使细胞代谢 向着有利于病毒 合成的方向进行,再依据病毒基因组 的指令，进行病毒 核酸的复制、 转录和
3、翻译,六、释放,出芽释放 溶细胞释放,组装： DNA病毒：一般在核内组装 RNA病毒：多数在胞浆内组装,病毒的致病作用,水平传播（Horizontal transmission）病毒主要通过皮肤、粘膜（呼吸道、消化道、泌尿生殖道）传播，在特定条件下直接进入血液（输血、机械损伤、昆虫叮咬等）而感染机体。所引起的感染，叫水平感染(Horizontal infection)垂直传播（Vertical transmission ） 经胎盘、产道，病毒直接由亲代(母亲)传播给子代(胎儿/新生儿)的传播方式。导致的感染，称为垂直感染( Vertical infection）,病毒感染的类型,（一）隐性感染
4、（inapparent or subclinical infection）非显性感染、亚临床感染病毒侵入机体内，不引起临床症状的感染 形成原因：病毒毒力弱、机体防御较强，病毒不能大量增殖，未造成细胞、组织严重损伤；或最终不能侵入靶细胞。意义：获得免疫力；,（二）显性感染（apparent infection）,病毒感染后，患者出现明显的临床症状可表现为局部和全身感染； 1、急性感染：潜伏期短，发病急，病程短，恢复后病毒被彻底清除，机体获得免疫力。如流感，甲肝等。 2、 持续性感染（persistent infection）：病毒在体内持续存在几个月,几年,几十年， 甚至终身携带，经常/反复有病
5、毒排除体外，但缺乏持续性的临床表现。,病毒能持续存在于体内的原因,病毒Ag弱，不足以引起机体免疫反应；病毒Ag变异，机体免疫系统不能有效识别；病毒基因整合在宿主细胞染色体上，病毒与细胞共存； 病毒直接侵犯免疫细胞，造成免疫功能下降;,1、慢性感染（chronic infection）显性、隐性感染后，病毒未完全清除，持续存在血液或组织中，处于持续增殖状态，并不断排出体外。临床症状可有、可无。病程长（数月、数年、数十年），病毒慢性进行性损伤机体，并能检出病毒的存在。 2、潜伏感染（latent infection）显、隐性感染后，病毒存在于一定组织或细胞内，不产生感染性病毒体。在某些条件下，病毒
6、基因被激活而急性发作，增殖出病毒颗粒，出现显性感染。,3、慢发病毒感染（slow virus infection）,又称迟发病毒感染（delay infection）;病毒感染后，在机体内经过长期潜伏(数月、数年、数十年)后，出现慢性进行性疾病，最终导致死亡;常见病毒引起：HIV AIDS;麻疹病毒亚急性硬化性全脑炎（SSPE）非常见病毒/待定致病因子引起： 朊粒羊痒疫(scrapie)，库鲁病( Kulu )等,病毒的致病机制,（一）病毒对宿主细胞的直接作用 1、杀细胞性感染 多见于裸露病毒 机制：- 阻断细胞大分子合成；- 破坏细胞溶酶体；- 病毒毒性蛋白的作用；,2、细胞膜的改变,细胞融
7、合 形成多核巨细胞，细胞功能受损。 细胞膜表面出现新抗原 病毒增殖，将自身蛋白表达在宿主细胞膜上，改变宿主细胞膜成分,3、细胞转化,某些病毒的DNA和宿主细胞的染色体整合，可使细胞遗传性状发生改变，导致肿瘤的发生 4、形成包涵体病毒感染C后，在光镜下可见，胞浆或核内出现嗜酸或嗜碱性的团块结构，称为包涵体。形成机制：V颗粒的聚集；V增殖的场所；C对V的反应产物；,C表面的V-Ag 细胞暴露的自身抗原,体液免疫 细胞免疫,损伤宿主C,肾毛细血管基底膜蛋白尿,血尿 V-Ag+Ab 关节滑膜关节炎肺部支气管炎、肺炎,A.,B.,IC,（二） 病毒感染的免疫病理损伤,1、体液免疫损伤（II,III型超敏
8、反应）受染细胞表面有V-Ag、IC沉积 自身免疫,2、细胞免疫损伤（IV型超敏反应） 3、直接损伤淋巴细胞或淋巴器官如：HIV直接损伤CD4+T细胞 （三）病毒的免疫逃逸通过编码特异性抑制蛋白或形成合胞体是病毒在细胞间传播。,第二节 宿主的抗病毒免疫,一、非特异性免疫：IFN, NK细胞 （一）、干扰素(Interferon, IFN) 1、定义：病毒或干扰素诱生剂刺激机体的多种细胞(巨噬细胞、淋巴细胞、体细胞等)，产生的抑制病毒增殖的糖蛋白。 2、 分类: IFN类型 主要来源 特点I型 IFN 人WBC IFN 人成纤维C 抑制病毒作用III II型 IFN TC 抗肿瘤、免疫调节作用II
9、I,IFN 细胞基因 抗病毒蛋白自身和邻近细胞降解病毒mRNA抑制病毒蛋白合成抑制病毒组装、释放抑制病毒复制中断病毒感染；限制病毒扩散,3、作用机理 不是直接杀灭病毒,4、生物学活性:,（1）、 广谱的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促进痊愈; （2）、调节免疫功能； （3）、 抑制肿瘤细胞生长；,（二）NK：非特异性杀伤病毒感染的靶细胞,特点：不受MHC限制、不依赖Ab；可通过多种途径活化；杀伤机制：NK接触靶C释放穿孔素、TNF破坏受染C,（一）、体液免疫：中和病毒 （二）、细胞免疫： 主要靠TC 释放穿孔素、颗粒酶，致敏TH1释放的多种淋巴因子发挥作用,二、特异性免疫,第三
10、十三章 病毒学检验基本技术,一、标本采集与送检： 原则：尽早采取 、部位适宜、冷藏速送：冰块或干冰、 50%的甘油缓冲盐水 、抗生素 双份血清标本：急性期、恢复期双份血清,二、快速检查方法,光镜-包涵体,电镜,免疫荧光,ELISA,分子生物学技术,杂交,Southern blot,PCR,Northern blot,三、病毒的分离培养,检验标本杀灭杂菌(青链霉素),接种,病毒分离的一般程序：,动物接种出现病状 鸡胚接种病变或死亡 细胞培养细胞病变,鉴定病毒种型,第三十四章 呼吸道病毒,1. 掌握呼吸道病毒的种类和致病特点；流行性感冒病毒、SARS冠状病毒、禽流感病毒、副黏病毒科病毒的生物特性和
11、微生物检验。 2. 熟悉流行性感冒病毒、SARS冠状病毒、禽流感病毒、副粘病毒科病毒的临床意义。 3. 了解其他呼吸道病毒的生物特性、临床意义和微生物检验。,教学目的与要求,呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，90%以上的急性呼吸道感染由该类病毒引起。,呼吸道病毒引起的主要疾病,呼 吸 道 病 毒,流行性感冒病毒,禽流感病毒,副粘病毒科,其它呼吸道病毒,第一节正粘病毒科 一、流行性感冒病毒（influenza virus）,（一）分类 据RNP和M蛋白抗原性分：甲、乙、丙三型 甲型根据HA和NA抗原性不同，又分若
12、干亚型（H1H16、N1N9） 乙型、丙型至今未发现亚型,（二）临床意义,“流行性感冒”（ Influenza ）是英国人John huzxam在1743年创造的字，他依据意大利语中用来描述这个疾病起源的片语“un infuenza di freddo”，即“寒冷的影响 ”。它主要发生在深秋、冬天和早春季节。每年都有数以百万计的人群受到感染。,50年代以来共三次,1957年，H2N2，贵州 1968年，H3N2，香港 1977年，H1N1，辽宁 先集体，后散居 先城市，后农村,传染源：显、隐性患者、感染的动物 传播途径：呼吸道飞沫传播V呼吸道粘膜柱状上皮C病变 坏死粘膜充血、水肿炎症 鼻塞、咽
13、喉肿痛、咳嗽、卡他等症状毒性代谢产物 （局部症状）入血 发热、头痛、肌肉酸痛、乏力等（全身症状） V不入血，只在呼吸道上皮局部增殖,（三）生物学特性,1、形态结构：流感病毒呈球形或丝状，球形直径80-120nm，新分离株丝状多于球形,有包膜，单链分片段的RNA病毒。,流感病毒结构,表面：血凝素(HA)柱状，为三聚体，基本上以相同的间距覆盖了病毒的全部表面HA1（吸附）HA2（核衣壳释放）血凝抑制抗体(保护性抗体) 神经氨酸酶（NA）四个亚单位组成的四聚体，并不平均分布在病毒表面，而是聚合成群。与病毒释放有关。,内部：1、核衣壳病毒分片段的RNA，结合有核蛋白（NP）以及与复制和转录有关的三种依
14、赖RNA的RNA多聚酶蛋白。呈螺旋对称。 2、基质蛋白（M蛋白）覆盖在核衣壳外面，M蛋白抗原性稳定，也具有型特异性。M1(增加包膜厚度)M2(辅助HA2释放核衣壳) 3、包膜来自宿主细胞的脂质双层膜。,流感病毒的内部结构,1、核衣壳 病毒分片段的RNA，结合有核 蛋白（NP）以及与复制和转录 有关的三种依赖RNA的RNA多 聚酶蛋白。呈螺旋对称。 2、基质蛋白（M蛋白） 覆盖在核衣壳外面，M蛋白抗 原性稳定，也具有型特异性。 M1(增加包膜厚度) M2(辅助HA2释放核衣壳) 3、包膜 来自宿主细胞的脂质双层膜。,NA,HA,包膜,基质蛋白,核衣壳,RNA,核蛋白,RNA 聚合酶,2、变异,抗
15、原漂移（antigenic drift）因HA或NA的点突变造成，变异幅度小，属量变，引起局部中、小型流行。 抗原转换（antigenic shift）因HA或NA的大幅度变异造成，属质变，导致新亚型的出现，引起世界性的暴发流行。,3、培养特性鸡胚培养：不引起鸡胚出现病变，取羊水或尿囊液做血凝试验细胞培养：红细胞吸附试验4、抵抗力较弱，不耐热，对干燥、乙醚、甲醛和乳酸等敏感。,微生物检验,病毒分离培养(金标准)取患者咽漱液或鼻咽拭，接种鸡胚或培养细胞 抗原检测直接从病人呼吸道分泌物、脱落细胞中检测抗原 分型鉴定核酸杂交、PCR、序列分析 血清学诊断血凝抑制试验、中和试验、补体结合试验、酶联免疫测定,二、 禽流感病毒,（一）临床意义,截止2013年5月11日，全国内地共报告人感染H7N9禽流感确诊病例130例，其中死亡人数33人，康复人数45人。病例分布于北京（1例）、上海（33例，死亡14例）、江苏（27例，死亡8例）、浙江（46例，死亡7例）、安徽（4例，死亡2例）、福建（5例）、江西（5例，死亡1例）、山东（2例）、河南（4例，死亡1例）、湖南（2例）10省市的39个地市。另有台湾1例。尚未发现人传人的证据。,
