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1、第十三章 免疫细胞分离与免疫细胞 功能检测及应用,【掌握】外周血单个核细胞、淋巴细胞、T细胞亚群分离的原理；T、B细胞、NK细胞主要的表面标志。各种淋巴细胞功能检测的原理.,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同,外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,密度梯度离心(Ficoll)离心,二 、淋巴细胞分离（去单核细胞）,贴壁粘附法
2、（单核细胞贴壁生长的特点、将悬液置玻璃或塑料器皿，未贴壁的为淋巴细胞，此法易造成B流失） 吸附柱过滤法（单核细胞贴壁生长的特点，将细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶的层析柱中，洗脱下来的为淋巴细胞） Percoll 分离液法（连续密度梯度离心，不同密度的细胞悬浮于各自不同的密度区带）,Percoll法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图,E花环沉降法 （T细胞与绵羊红细胞 形成E花环后用淋巴细胞分层液分离， E花环沉在管底） 尼龙毛柱分离法 （B细胞和单核细胞易粘附于尼龙纤维表面，将用HANKS液浸泡后的单个核细胞悬液加入充填有尼龙毛的聚乙烯塑料管内，洗脱液中为T细胞，然后边冲边挤压塑料管
3、，洗下B细胞。,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离,大小免疫磁珠分离细胞的特点比较,第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类,常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗（CD）。,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+ Foxp3 +调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）,辅助性T细胞,Th1（IL-2、IFN-、TNF-CD3+CD4+CD30- ),Th2（IL-4、IL-5、IL-6或
4、IL-10CD3+CD4+CD30+）,细胞毒性T细胞,Tc1（CD3+CD8+CD30- ),Tc2（CD3+CD8+CD30+）,调节性T细胞,CD4+CD25+调节性T细胞,CD8+调节性T细胞,二、B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体都是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。成熟B细胞的mIg主要为mIg M、mIgD。,CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD5
5、6来认定，临床上将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞认定为NK细胞。,三、NK细胞表面标志,第三节抗原提呈细胞表面标志的检测,抗原提呈类细胞表面标志,第四节 淋巴细胞功能检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是进行迟发型超敏反应，间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应.体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定.,淋巴细胞分类,T细胞（负责细胞免疫功能） B细胞（执行体液免疫功能） NK和K细胞（非特异性免疫作用）,1. 原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核
6、仁明显,核染色质疏松,（一）T淋巴细胞增殖试验,2. 淋巴细胞转化的刺激物,非特异性刺激物：PHA -T细胞ConA -T细胞PWM -T、 B细胞LPS -B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原,同位素法：PHA 淋巴细胞（54h） DNA合成期 + 3H-TdR掺入 收集细胞检测射线,测定细胞内的3H-TdR,3. 检测方法,形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化,（1）形态学检查法,方法学评价：,优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。 缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。,（2）3H-TdR掺入法,优
7、点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,（3）MTT比色法,(二) T细胞分泌功能测定,体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。,1.原理：,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,（三）T细胞介导的细胞毒试验,形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定射线,2.方法,意义：肿瘤患者CTL杀伤
8、肿瘤细胞的能力,(四) 体内试验,特异性抗原皮肤试验 PHA皮肤试验,二、B细胞功能检测,溶血空斑试验 B细胞抗体形成功能的检测 体内试验,2. 方法学：,经典溶血空斑形成试验 被动溶血空斑试验,(一) 溶血空斑试验,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响 评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,应用与方法学评价：,该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。 优点： 稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,(二) 酶联免疫斑点法,三、NK细胞活性测定,靶细胞溶解,常用靶细胞: K562细胞
9、株(人）YAC-1细胞株(小鼠）,方法学及原理,吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。一、中性粒细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术,第五节 其他免疫细胞功能检测技术,一、中性粒细胞功能的检测,细胞趋化功能的检测吞噬和杀菌功能的检测,(一) 趋化功能检测,1.原理：,琼脂糖平板法,(二)吞噬和杀菌功能测定,1显微镜检查法：,2. 溶菌法,3NBT还原试验,二、巨噬细胞功能检测,(一)炭粒廓清试验,正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。,(二)吞噬功能检测,巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。,反映机体免疫功能状态。 肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。 组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。,第六节 免疫细胞表面标识和功能检测的临床应用,
