《蛋白质组学概论》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质组学概论（43页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一、蛋白质组学,2003年4月14口，国际人类基因组序列联盟正式宣布人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)圆满结束，辨认了大约32000个基因，并提供四类图谱: 遗传图谱、物理图谱、基因图谱和基因序列，描绘了生命周期表的第一页。,真正在细胞内和细胞间发挥各种生物学作用的是蛋白质类物质，即基因表达的产物，因此对蛋白质功能的研究就显得更有意义。 生物学也因此在HGP完成后,被重新划分为前基因组时代和后基因组时代两部分。 我们正生活在后基因组时代。,1. 蛋白质组学概念 蛋白质组(proteome)概念于1994年由澳大利亚科学家Marc Wilkins首次提出，是蛋白
2、质（protein）和基因组（genome）两个词的组合词，意思是proteins expressed by a genome, 即基因组表达的全套蛋白质。由于受到基因表达调控的影响，基因表达存在着时间、空间、个体间的差异，即使在同一个体内，不同阶段和不同生理状态下，基因表达的情况也不相同，因此蛋白质组是一个动态的概念。,蛋白质组学（Protemics）则是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。,蛋白质组学的研究方法,2.表达蛋白质组学的技术平台双向凝胶电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）
3、质谱技术（mass spectrometry, MS）生物信息学（biological informatics）,双向凝胶电泳原理：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，先经等电聚焦电泳(isoelectric focusing， IEF)，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离。 1975年由OFarrell等首先创立，Bjellqvist等发展并完善固相pH梯度等电聚焦技术，为首选的蛋白质分离技术。,固定pH梯度胶条（ immobilized pH gradients，IPG）,第一向电泳等电聚焦仪,第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium
4、dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）,单向SDS-PAGE电泳图,双向电泳凝胶图,1.差异凝胶电泳(Differences gel electrophoresis),2.毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE),3.高效液相色谱(High performance liquid chromato-graphy，HPLC),其他用于蛋白质电泳的方法,激光捕获显微切割技术 (Laser Capture Microdissection, LCM),典型的激光捕获显微切割设备包括了脉冲激光、
5、照相机和电脑控制电动载物台的倒置显微镜。激光束的位置通过操纵杆由电脑控制，沿着设定好的路径或几何图形的形状，自动切割后即可获得需要的特定细胞或组织，并存放到收集管中。 操作时根据图像选好目的区域，由传动臂将透明的热塑薄膜精确放置在组织切片上方。被切割组织区域的薄膜受到适当强度的激光照射后瞬间温度升高到90左右融化，并包埋下方组织，形成组织复合物。激光发射结束，机械臂将盖子和薄膜从切片中移出时，由移动臂自动转至Ep离心管。,质谱技术20世纪80年代后期，基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI）和电喷雾电离（ele
6、ctrospray ionization, ESI）两种“软电离” 技术的出现使得质谱技术得到迅速的发展，成为蛋白质鉴定的核心技术。所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption /ionization time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOP-MS）,MALDI-TOP-MS工作原理,双向电泳与质谱技术的联合应用成为蛋白质组学研究的基本技术平台。,生物信息学随着人类基因组计划、计算机网络技术的发展而诞生的一门新兴学科，是蛋
7、白质组学研究中不可缺少的一部分。 在蛋白质组学研究中有两个重要应用：一是分析和构建双向凝胶电泳图谱，二是搜索与构建蛋白质组数据库。,生物信息学的组成,数据库 用于蛋白质鉴定的数据库主要有以下几类：1. 蛋白氨基酸序列数据库；2. 蛋白质结构域与家族数据库；3. 蛋白质高级结构及分类数据库；4. 蛋白质 2-DE 图谱数据库；5. 蛋白质相互作用数据库。工具软件 蛋白质组学研究中使用的软件主要有以下几类：1. 蛋白质双向电泳图谱分析软件； 2. 蛋白质鉴定软件；3. 蛋白质结构和功能预测软件。,蛋白质数据库,表达蛋白质组学研究的基本流程,蛋白样品的制备及定量总蛋白的双向凝胶电泳（染色） 凝胶分析
8、软件分析胶内酶解（胰肽酶）质谱分析（肽质量指纹图谱）数据库搜索鉴定蛋白性质,样品制备的原则,1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的 总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。,样品制备的主要试剂,离液剂(chaotropes)，主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea），主要作用是改变或者破坏蛋白质次级键，使蛋白质肽链展开； 表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，主要作用是破坏蛋白质去折叠后肽链之间的疏水作用，而非离子去垢剂和双性离子去垢剂由于没带电荷或带有等电荷，在等电聚焦中不影响蛋白
9、质的等电点而被广泛采用； 还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），主要作用是破坏蛋白质分子间的二硫键，以利于肽链的分离； 蛋白酶抑制剂，如EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails，主要作用是防止蛋白的降解。 蛋白质样品中核酸等大分子物质必须除去，因为核酸的残留将影响第2向SDS-PAGE中高分子量蛋白分离，导致明显的纵向拖尾。,双向电泳凝胶图,凝胶软件分析,蛋白点获取及胶内酶解,质谱分析肽质量指纹图谱,生物信息学Mascot 软件搜索蛋白得分图,Match to: G02639 Score: 87 Expect: 0.
10、0043 capping protein alpha subunit isoform 1 - human Nominal mass (Mr): 32902; Calculated pI value: 5.45 Number of mass values searched: 16 Number of mass values matched: 8 Sequence Coverage: 39%,二、肿瘤标志物(tumor marker, TM),肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率性疾病,大量研究和防治资料证实,早期诊断和早期治疗是防治肿瘤与降低死亡率的最有效办法。因此, 寻找能早期诊断的肿瘤
11、标志物成为了人们关注的焦点。,肿瘤标志物的研究现状从临床诊断肿瘤的需求考虑,人们设想的理想TM 应具有以下特性: 灵敏度高,能早期发现和早期诊断肿瘤；特异性好,仅肿瘤患者阳性,能对良恶性肿瘤进行鉴别诊断； 能对肿瘤进行定位,具有器官特异性；与病情严重程度、肿瘤大小或分期有关；能监测肿瘤治疗效果和肿瘤的复发；能预测肿瘤的预后。,目前应用于临床的肿瘤标志物可分为以下几类:(1)肿瘤胚胎性抗原,如CEA ( carcinoembryonic antigen)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)； (2)异位激素,如绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotr
12、opin,HCG)、前促胃液素释放肽(Pro-gastrin-releasing peptide, ProGRP)； (3)酶和同工酶,如神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、乳酸脱氢酶(lactate dehydyogenase,LDH)、前列腺酸性磷酸酶(prostate gland acidity phosphatase,PAP)； (4)血浆蛋白,如2-巨球蛋白； (5)细胞代谢产物,如细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment,CYFRA)、脂质相关涎酸； (6)肿瘤抗原,如癌抗原1-29、癌抗原-125； (7)癌
13、基因和抑癌基因蛋白产物,如C-myc 基因蛋白、Ras基因蛋白、P53抑癌基因蛋白； (8)微量元素,如砷、铜、铁、硒、锌。,100多种肿瘤标志物经过10多年的临床实践发现TM 并没有想象的那么理想，引起了医学界的争议：,1.它能否早期诊断? 2.能否对人群进行普查? 3.其临床意义有多大? 4.TM 的前途如何?,究其原因，主要是由于目前常用的TM灵敏度和特异性不高,既存在于肿瘤患者血液和体液中,也存在于正常人群和非肿瘤的其他病人的血液和体液中, 故目前主要只能用于肿瘤的辅助诊断,不能单凭TM 超过参考范围而进行诊断,也不提倡对无症状人群进行普查。因此,人们期待通过“一滴血”早期发现肿瘤的希
14、望从现有的肿瘤标志物来看，还难以实现。,寻找针对不同肿瘤的高特异性的新型肿瘤相关抗原的研究显得必要和迫切，而蛋白质组学的研究方法为其提供了有力的技术支持。,蛋白质组学研究方法，具有在整体水平上高通量发掘与寻求特异性标志物的巨大能力，因此蛋白质组学研究的技术平台一经建立，就得到肿瘤研究者的广泛重视，尤其在恶性肿瘤的研究方面，结合蛋白质组学技术，产生出以寻找肿瘤特异性分子标志物为主要研究内容的学科肿瘤蛋白质组学。,三、肿瘤蛋白质组学,肿瘤蛋白质组学两种主要研究方法： 比较蛋白质组学 血清蛋白质组学,比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织）之间蛋白质在表达数量、表达位置和修
15、饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或着发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。 肿瘤细胞是由正常细胞转变而来，与其起源的正常细胞相比，有许多与正常细胞相同的蛋白质，同时也含有一些正常细胞所没有的某些特异蛋白质或缺少正常细胞所具有的某些特异蛋白质。,肿瘤血清蛋白质分析方法（tumor serologic proteome analysis， SERPA）：是从肿瘤免疫学观点出发建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法。 从肿瘤免疫学的观点来看，肿瘤细胞是“非己细胞”，肿瘤细胞总是或多或少地表达区别于正常细胞的肿瘤抗原,因而在患者血清中极有可能存在其相应的抗体，该技术结合蛋白质组学能分
16、离肿瘤细胞内成千上万个蛋白质的优势，和抗原抗体反应高度特异性的特点，从而能够快速筛选出与肿瘤密切相关的蛋白质，进而识别出肿瘤的分子标志物。,SERPA其实验过程如下： 双向电泳分离肿瘤组织（细胞）总蛋白质； 转膜； 建立western blotting蛋白质印迹反应图谱（与患者或正常人血清反应）； 软件分析确定差异反应的蛋白质斑点； 质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶(replica gel)中相应的差异蛋白质点进行鉴定，筛选出肿瘤分子标志物； 用ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证，或者进一步分析该蛋白功能，研究其在肿瘤进展中发挥的作用。,2-D Western blotting差异反应图谱,肺腺癌患者血清 良性肺部疾患患者血清,
