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1、RNA干扰技术基本原理与应用,什么是RNA干扰,RNA干扰(RNA interference，RNAi),又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降.,2001、2002年连续被Science评为年度十大成就!,目前应用的基因干扰技术,DNA水平的基因干扰技术 基因敲除技术 寡核苷酸与双链DNA 杂交 采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子,目前应用的基因干扰技术,mRNA水平的基因干扰技术 用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源性mRNA 设
2、计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质, 使mRNA 不稳定 双链RNA 干扰技术（RNAi）,RNAi的发现和发展历程,1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实验“共抑制(co-suppresion)”,RNAi的发现和发展历程,1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达 实验 首次发现 RNA干扰现象 1998年 Andrew Fire和Craig Mello 发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA可高效、特异地抑制
3、基因的表达 Nature1998； 391: 806-11 正式提出RNA干扰的概念,RNAi的发现和发展历程,1999年 Tuschl等报道在哺乳动物中也存在RNAi 2001 年 Berstein 等提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应，并发现体内分解dsRNA 为siRNAs (short/small interfering RNA) 的DICER 酶,RNAi的发现和发展历程,2002 年 Novina 等用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑 2004年 Morris 等用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制Science 2004(August 27)；305
4、：1289-1292,RNAi的主要特点和优势,诱导转录后水平的基因沉默 具有高度的特异性 抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去“基因沉默系统化”,siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶,共同点特异性靶向性,siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶,不同点 独特的双链结构 需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等协同因子 siRNA 本身无催化活性 在细胞内可能具有相对的稳定性 具有一定的可遗传性,RNAi的主要过程,启动阶段dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA 长度：21-25nt 结构：3端悬垂
5、两个未配对的碱基UU,细胞中内源性dsRNA的形成,基因组中DNA 反向重复序列的转录产物 同时转录反义和正义RNA 病毒RNA 复制中间体 以单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA,Dicer酶,RNAase III超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶结构域，一个双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA 广泛存在,RdRp（RNA dependent RNA polymerase）,使异常的RNA转变为dsRNA 参与细胞内dsRNA和siRNA的
6、扩增 siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp，形成大量的dsRNA,RNAi的主要过程,效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成 RISC的激活：ATP依赖的解双链过程 在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别），RISC特异性切 割、降解靶mRNA，导致基因表达失活,RNAi技术的实验方法,siRNA的设计原则 序列大小 19-21nt ，最好以A或G开始 从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列，作为潜在的RNAi靶位点 不要针对5和3端非编码区（untranslated regions，UTRs),RNAi技术的
7、实验方法,siRNA的设计原则 设计24个序列, BLAST 比对基因序列以确保序列设计的特异性 优先选择 GC 含量30-50%的序列 设计适当的阴性对照序列,阴性对照序列的设计,特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG 在特异性siRNA引入12个错配碱基AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAG,目标序列筛选的相关网站,http:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html http:/sfold.wadsworth
8、.org/sirna.pl http:/ http:/RNAiD http:/ http:/katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html,查找已经证实的siRNA的网站,http:/ http:/ http:/web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html http:/ 化学合成siRNA 体外转录获取siRNA 利用Dicer或 RNase消化长的dsRNA成siRNA,化学合成法制备siRNA,优点： 纯度高 合成量不受限 能被标记 缺点：价格昂贵、合成周期长 用途：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进
9、行研究,体外转录法制备siRNA,优点：简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性好 缺点：反应规模和量始终有一定的限制 用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs,消化法（ “ siRNAs 鸡尾酒 ”）,优点：无需检测或筛选多个siRNA序列产生多种 siRNAs 混合体，保证有效的目的基因沉默 缺点：有可能引发非特异的基因沉默 用途：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型,siRNA的制备方法,细胞内制备方法 依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA 通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA,siRNA载体,依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III) ，操纵一
10、段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。 人源U6启动子 鼠源的U6启动子 人H1启动子 pol III可在细胞中表达许多的小分子RNA，通过添加一串（36个）U来终止转录的 需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链再克隆到载体中,表达载体法制备siRNA,优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久 缺点：需要进行克隆，周期长，质粒载体表达效率较低 用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法,基于PCR的siRNA表达框架(SECs),组成：RNA pol III启动子发夹结构siRNARNA pol III终止位点 制备：PCR ，无需克隆和测序,用SECs
11、制备siRNA,优点： 可直接由PCR得到，方法简便，时间短 在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出 最有效的siRNA可用于构建表达载体 可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的最适搭配,用表达框架制备siRNA,缺点： PCR产物很难转染到细胞中 不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想 用途： 筛选siRNA序列 在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子,shRNA(short hairpin RNA) 文库,Nature 2004 ；428： 427 - 431 (25 March)针对：9,610 human genes5,563 mouse
12、genes构建成：28,000个shRNA表达盒(cassettes) 商品化试剂盒：Expression Arrest (美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司)网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程,CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点 Barcode：每个shRNA独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择 Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列,siRNA转染细胞,.磷酸钙共沉淀 电穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 机械法 ：显微注射和基因枪 阳离子脂质
13、体试剂,提高转染效率的方法,纯化的siRNA 避免使用抗生素 避免RNA酶污染 较低传代数的细胞 合适的转染试剂 合适的阳性对照 荧光标记的siRNA,RNAi技术的应用,基因组功能研究的新方法 研究信号传导通路的新途径 开展基因治疗的新策略 （抗病毒、抗肿瘤等） 筛选药物靶点的新工具,RNAi技术抗病毒,作用 阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录 自然界中普遍存在 在医学上的应用 RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰质炎病毒 DNA病毒：如HBV,RNAi技术阻止HIV的入侵,Novina将针对CD4的dsRNA导入 能表达CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 细胞系），能使
14、细胞表面CD4 表达减少75%；转染后60 小时后, 再用H IV 感染, 结果发现CD4-siRNA 转染的细胞很少有包涵体出现 其它试验的受体： CCR 5、CXCR4,RNAi技术抑制HIV的复制,将HIV-1编码rev的基因和同源的dsRNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制 siRNA抑制HIV rev-EGFP的表达，其抑制率可达到90；而反义RNA，核酶组与对照组无显著差异,RNAi技术抑制HCV的复制,RNAi技术抑制HBV的复制,HBV是DNA病毒，但是其复制过程需经过逆转录的过程。 针对HBV的S，C，X，P基因序列及DR1，DR2等调控元件序列，设计的siRNA可显著抑制HBV的复制和蛋白表达,McCaffrey, et al. Nature Biotech 2003;pp1-6,谢 谢!,
