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1、 目 录第一章 流式细胞仪简介.11.1 流式细胞术发展史 11.2 流式细胞仪构造和工作原理 21.2.1 概述.21.2.2 流式细胞仪构造.21.3 流式细胞仪的主要技术指标 10第二章 FACSCalibur 的日常操作 122.1 FACSCalibur系统 122.2 FACSCalibur开机程序 152.3 FACSCalibur关机程序 162.4 FACSCalibur的维护与保养 172.4.1 FACSCalibur的每月维护 .172.4.2 FACSCalibur的定期维护 .182.5 常见故障排除 20第三章 FACSComp软件 .223.1 FACSComp
2、简介 223.1.1 FACSComp运行条件 .223.1.2 FACSComp的文件类型 .233.2 FACSComp的功能 243.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节 243.2.2 荧光补偿的调节.243.2.3 灵敏度的测试.243.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT） .253.2.5 HLA-B27的校准 253.2.6 LeucoCOUNT .253.2.7 优化.253.3 FACSComp的运行 253.3.1 CaliBRITE Beads的准备 253.3.2 软件环境的设置.263.3.3 Beads的检测 .263.3.4 Optimiza
3、tion .283.4 Troubleshooting 28第四章 FACStation 数据管理系统 .304.1 FACStation 数据管理系统组成 304.2 FACStation文件组成 .314.2.1 如何建立文件夹.314.2.2 FACStation文件的类型 314.2.3 如何管理文件.324.3 实用的Macintosh OS 功能 .344.3.1 菜单栏.354.3.2 Dock 374.3.3 查找窗口.374.3.4 键盘快捷键.384.4 如何设置模版 394.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 404.6 可选性存储装置 40
4、4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则.404.6.2 光驱的维护.414.6.3 光盘的维护.41第五章 CellQuest Pro软件 425.1 概述 425.1.1 获取(Acquisition） .425.1.2 分析(Analysis) 425.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) .425.2 工具栏 425.3 CellQuest Pro 的文件 435.3.1 FCS数据文件 .435.3.2 实验文件.445.3.3 仪器条件文件.445.3.4 统计文件.445.4 CellQuest Pro 的仪器控制 445.4.1 探测器.455.4.
5、2 放大器.455.4.3 阈 值465.4.4 补 偿465.4.5 状 态475.5 CellQuest Pro 的视图 485.6 练习：3色或4色数据获取 485.6.1 质控运行FACSComp .485.6.2 优化.505.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 525.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值 535.6.5 设置淋巴细胞Region 535.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压）.535.6.7 调节荧光补偿.555.7 实验练习：3色/4色预获取 .555.7.1 设置Acquisition (2)激光光源及光束成形系统
6、; (3)光学系统; (4)信号检测与存贮、显示、分析系统，(5)细胞分选系统。见图一。 (一)、流动室与液流驱动系统 流动室(Flow Chamber或 Flow Cell)是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻1流式细胞仪简介2 2BD FACSCalibur 中文培训手册 璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为 430180um 的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。 流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流
7、动，操作人员无法随意改变其流动的速度,样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 图 二 细 胞 流 和 鞘 液 流 的 驱 动 一 般 采 用 加 正 压 的 方 法 ， 流 速 与 压 力 的 关 系 服 从 Bernoulli方程，即 P = () pv2 (忽略高度的变化)，可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速, 从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。 低速低速(Low) 高速高速(Hi) 图 三 从图二可以知道,真空泵产生压缩空气,通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力(
8、压 1流式细胞仪简介3 3 3BD FACSCalibur 中文培训手册 图 四 力的大小由工厂设定)，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度，但是，这并不是提高样本流的速度，而是改变了细胞间的距离，从图三可以看出，样本流变宽，细胞间距离缩短,这样单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加。这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布(见图四)，中心处能量最高，因此当样本速率选择高速(Hi)时，处在样本流不位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这就会造成测量误差，当在检测分辨
9、率要求高的实验时(如 DNA analysis)应选用低速(Low)。 （二） 、激光光源与光束成形系统 目前台式机 FCM，大多采用氩离子气体激光器，BD 公司的 FACSCallibur 可增配小功率半导体激光器（波长 635nm)从而拓宽了其染料的应用范围。 激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞的快速流动， 每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右， 每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号
10、强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。 激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为 22 66 um 即短轴稍大于细胞的直径的光斑(见图四)。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，台式机 FCM 的光路调节对用户是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后， 无需用户作任何调节，所以用户操作十分方便。 （三） 、光学系统 FCM 的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 在FCM的光学
11、系统中主要光学原件是滤光片( Filter )， 主要分为三类： 长通滤片 （Long-Pass Filter，LP )、短通滤片( Short-Pass Filter,SP) 及带通滤片( Band-Pass Filter, BP )。 (1) 长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如 LP500 滤片，将允许 500 nm以上的光通过，而 500 nm以下的光吸收或返回。 1流式细胞仪简介4 4BD FACSCalibur 中文培训手册 图图 五五 (2) 短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。 图 六 (3) 带通滤片：带通
12、滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光波段的范围。如 BP 500 / 50 表示其允许通过波长范围为475nm525nm。 图图 七七 （四） 、信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间 360 度立体角发射，产生散射光和荧光信号，图八是以激发光光源波长 488nm为例的示意图： 1流式细胞仪简介5 5 5BD FACSCalibur 中文培训手册 图图 八八 散射光信号：散射光分为前向角散射( FSC ，Forward Sca
13、tter ) 和侧向角散射(SSC，Side Scatter)，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数） 。 (1) 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在 FCM 应用中，选取 FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 (2) 侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交 900方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 上述两种信号都是来自于激光源光束，其波长与激光相同，目前采用这两个参数组合，可区分红
14、细胞裂解处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行红细胞裂解处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。 荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。 荧光染料可选用的荧光素有多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选择染料或单抗所标记的荧光素必须考虑仪器所配置光源的波长，目前台式机 FCM 常配置的激光器为 488nm，通常可用染料有 P
15、I(propidium iodide)、PE(phycoreythrin)、FITC(fluorescein isothiocyanate)、PerCP(peridinin chlorophyll protein)、CY5 等。 另外， BD公司推出的 FACSCalibur还可配置半导体激光器 （波长为 635nm） ， 可激发 APC、 To-Pro3等染料，更拓宽了流式细胞仪的应用范围。 (1) 荧光信号线性测量和对数测量： 荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路完成。从图一可知，当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(P
16、MT)，PMT将光信号转换成电信号。有些厂家不采用光电倍增管(PMT)，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度， 但其最大缺点是响应速度慢， 造成仪器分析细胞速度降低， 最高不可能超过 3300个/秒，如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此高档机器不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞 DNA 含量、RNA 含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器，如果原来输出是 1，当输入增大到原来十倍时，输出为 2；当输入增大到原来一百倍时输出为 3 等。在免疫学
