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1、免疫毒性研究应注意的问题吕秋军吕秋军吕秋军吕秋军杰华杰华(北京北京)生物医药研究院生物医药研究院杰华杰华(北京北京)生物医药研究院生物医药研究院免疫毒性免疫毒性免疫毒性免疫毒性 免疫毒性免疫毒性是指受试品引起免疫抑制或增强是指受试品引起免疫抑制或增强、过敏反应或自过敏反应或自是指受试品引起免疫抑制或增强是指受试品引起免疫抑制或增强、过敏反应或自过敏反应或自 身免疫反应，可能与药理活性相关（如抗排斥药身免疫反应，可能与药理活性相关（如抗排斥药 物物）不相关不相关（如部分抗肿瘤药物如部分抗肿瘤药物）可能有关可能有关物物）、不相关不相关（如部分抗肿瘤药物如部分抗肿瘤药物）、可能有关可能有关 （如抗炎
2、药物）。（如抗炎药物）。杰华生物杰华生物杰华生物杰华生物研究意义研究意义研究意义研究意义 意义意义免疫抑制免疫抑制，感染感染，肿瘤肿瘤免疫抑制免疫抑制，感染感染，肿瘤肿瘤免疫增强，放大自身免疫反应或过敏反应免疫增强，放大自身免疫反应或过敏反应 存在问题存在问题在规范及指导原则方面在规范及指导原则方面缺乏共识缺乏共识实验方法也实验方法也在规范及指导原则方面在规范及指导原则方面，缺乏共识缺乏共识，实验方法也实验方法也 不统一，比如不统一，比如:FACS方法的验证（样品预处理、标记后稳定性、方法的验证（样品预处理、标记后稳定性、 CVs)CVs)杰华生物杰华生物免疫毒性研究内容之一免疫毒性研究内容之
3、一免疫毒性研究内容之一免疫毒性研究内容之一 常规的免疫毒性指标常规的免疫毒性指标(啮齿与非啮齿类啮齿与非啮齿类)包括：包括：白细胞总数及其分类计数白细胞总数及其分类计数白细胞总数及其分类计数白细胞总数及其分类计数 球蛋白和白球蛋白和白/球比值球比值 补体水平补体水平补体水平补体水平 淋巴器官淋巴器官/组织的大体解剖组织的大体解剖 胸腺和脾脏的器官重量胸腺和脾脏的器官重量 免疫病理免疫病理：胸腺胸腺、脾脏脾脏、引流淋巴组织引流淋巴组织免疫病理免疫病理：胸腺胸腺、脾脏脾脏、引流淋巴组织引流淋巴组织杰华生物杰华生物常规的免疫毒性检测常规的免疫毒性检测 免疫抑制/增强 全血细胞变化、白细胞变化或淋巴细
4、胞变化等。全血细胞变化、白细胞变化或淋巴细胞变化等。 免疫器官重量改变或组织学检查显示相关器官或 组织细胞密度变化免疫器官重量改变或组织学检查显示相关器官或 组织细胞密度变化 血清免疫球蛋白变化血清免疫球蛋白变化 用药组感染发生率用药组感染发生率 用药组肿瘤发生率用药组肿瘤发生率(除遗传毒性除遗传毒性、激素效应或肝酶激素效应或肝酶用药组肿瘤发生率用药组肿瘤发生率(除遗传毒性除遗传毒性、激素效应或肝酶激素效应或肝酶 诱导外诱导外)杰华生物杰华生物举例举例: :常规的免疫毒性检测结果常规的免疫毒性检测结果举例举例: :常规的免疫毒性检测结果常规的免疫毒性检测结果引流淋巴组织检查图 1猴经口免疫HI
5、V-BPV 假病毒后回肠粘膜下集合淋巴小结图 1猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后回肠粘膜下集合淋巴小结：对照组，：高剂量组杰华生物杰华生物免疫毒性研究内容之二免疫毒性研究内容之二免疫毒性研究内容之二免疫毒性研究内容之二 需要进行额外的免疫毒性试验的情况需要进行额外的免疫毒性试验的情况:(1) 常规免疫毒性检测结果提示免疫毒性常规免疫毒性检测结果提示免疫毒性感染感染(1) 常规免疫毒性检测结果提示免疫毒性常规免疫毒性检测结果提示免疫毒性，感染感染(2) 受试品的结构，与已知免疫调节剂相似受试品的结构，与已知免疫调节剂相似(3) 药代动力学结果药代动力学结果:原型药或代谢产物在免疫组织原型药或代
6、谢产物在免疫组织蓄积蓄积蓄积蓄积(4) 适应症适应症:如用于抗如用于抗HIV药物药物( )(5) 药理作用药理作用:常对免疫系统有影响常对免疫系统有影响,如抗炎药物如抗炎药物额外的免疫毒性试验项目额外的免疫毒性试验项目额外的免疫毒性试验项目额外的免疫毒性试验项目 免疫功能检测免疫功能检测如如T细胞依赖的抗体反应细胞依赖的抗体反应NK细胞活性细胞活性如如T细胞依赖的抗体反应细胞依赖的抗体反应、NK细胞活性细胞活性、 CTL活性、细胞因子表达、巨噬细胞活性、细胞因子表达、巨噬细胞/中性粒中性粒 细胞功能、皮肤超敏反应、宿主抵抗力研细胞功能、皮肤超敏反应、宿主抵抗力研 究究）究究） 免疫表型检测免疫
7、表型检测依据免疫学理论和具体靶分子种类依据免疫学理论和具体靶分子种类杰华生物杰华生物额外的免疫毒性试验设计额外的免疫毒性试验设计额外的免疫毒性试验设计额外的免疫毒性试验设计 单独进行免疫毒性试验单独进行免疫毒性试验啮齿类与非啮类动物啮齿类与非啮类动物 方案与常规毒性相方案与常规毒性相一一致致啮齿类与非啮类动物啮齿类与非啮类动物,方案与常规毒性相致方案与常规毒性相致多个剂量组多个剂量组高剂量高剂量NOAEL 调整原有标准毒性试验的方案调整原有标准毒性试验的方案,如增加免疫学指标如增加免疫学指标 增设增设卫星组卫星组 测量免疫学指标测量免疫学指标 增设增设卫星组卫星组,测量免疫学指标测量免疫学指标
8、额外的免疫毒性试验设计额外的免疫毒性试验设计额外的免疫毒性试验设计额外的免疫毒性试验设计 发育免疫毒性发育免疫毒性在成年动物中发现免疫抑制作用后或用于儿童用药在成年动物中发现免疫抑制作用后或用于儿童用药在成年动物中发现免疫抑制作用后或用于儿童用药在成年动物中发现免疫抑制作用后或用于儿童用药，需要评价发育免疫毒性作用，需要评价发育免疫毒性作用 观察母代暴露于药物后仔代的淋巴系统、血液系统、观察母代暴露于药物后仔代的淋巴系统、血液系统、细胞因子等细胞因子等两种以上功能检测等两种以上功能检测等 RSV感染模型感染模型细胞因子等细胞因子等，两种以上功能检测等两种以上功能检测等,RSV感染模型感染模型.
9、免疫抑制免疫抑制过敏过敏自身免疫等均有可能自身免疫等均有可能 常规阶梯或分层或标准试验组合不一定合理，需个常规阶梯或分层或标准试验组合不一定合理，需个体化体化据试药物特点据试药物特点包括体外试验包括体外试验体化体化,依依据据受受试药物特点试药物特点设计设计,包括体外试验包括体外试验 杰华生物杰华生物额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法免疫功能检测之一免疫功能检测之一巨噬细胞巨噬细胞/ /中性粒细胞中性粒细胞荧光标记的胶珠观察荧光标记的胶珠观察phagocytosisphagocytosis巨噬细胞巨噬细胞/ /中性粒细胞中性粒细胞荧光标记的胶
10、珠观察荧光标记的胶珠观察phagocytosisphagocytosis 等天然杀伤细胞（天然免疫）LDH法等天然杀伤细胞（天然免疫）LDH法T淋巴细胞功能有丝分裂原反应/混合淋巴细胞反 应51Cr释放法，ELISPOT法B淋巴细胞功能有丝分裂原反应 钥孔血蓝蛋白 (KLH），用ELISA等 测IgG/IgM细胞因子ELISA法及胞内细胞因子检测等细胞因子ELISA法及胞内细胞因子检测等杰华生物杰华生物额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法 免疫功能检测之二免疫功能检测之二hypersensitivity目前预测IV型变态反应：hypersen
11、sitivity目前预测IV型变态反应：Buehler试验、豚鼠最大化试验（GPMT）、Buehler试验、豚鼠最大化试验（GPMT）、小鼠 耳肿胀试验、小鼠局部淋巴结试验(LLNA)小鼠 耳肿胀试验、小鼠局部淋巴结试验(LLNA)autoimmunity PLNA（报告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）autoimmunity PLNA（报告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）host resistancehost resistance抗感染或抗肿瘤发生抗感染或抗肿瘤发生（整体整体，必要时必要时）：）：hosthost resistanceresista
12、nce 抗感染或抗肿瘤发生抗感染或抗肿瘤发生（整体整体，必要时必要时）：）：Listeria monocytogenes/ Streptococcus Listeria monocytogenes/ Streptococcus p pneumoniae (intratracheal)neumoniae (intratracheal)p p Toxoplasma gondii （Toxoplasma gondii （弓形虫） /Syngeneic tumor cells） /Syngeneic tumor cells注：GPMT与人一致性约70%，LLNA约72%，单核细胞增多性李氏杆菌 杰华生
13、物杰华生物额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法额外的免疫毒性试验方法 免疫表型检测免疫表型检测常用流式细胞仪检测常用流式细胞仪检测，检测表达水平和比例检测表达水平和比例常用流式细胞仪检测常用流式细胞仪检测，检测表达水平和比例检测表达水平和比例SurfacemarkersIg+PanB cellsThy 1.2+ or CD3+ Pan T cellsCD4+CD8-T Helper/delayed-type hypersensitivity cellsCD8+CD4-T Suppressor-cytotoxic cellsCD8+CD4+ Immature T c
14、ellsCD3-/CD16+或CD56+NK杰华生物杰华生物免疫功能检测举例免疫功能检测举例免疫功能检测举例免疫功能检测举例 分泌IFN细胞图 2 Quantification of BPV-Gag (HIV-1 p24)-specific T cells by ELISPOT图Qg (p)py杰华生物杰华生物免疫功能检举例免疫功能检举例免疫功能检免疫功能检测测举例举例细胞因子检测Cytokines Multi-Analyte ELISArray，同时测，同时测6个样本，个样本，12种因子种因子免免疫疫细胞细胞表表型检测举例型检测举例疫表疫表 CD22阳性比例1416C101212周 恢复期4
15、周D22阳性68细胞比例24例（%）0 Control25mg/kg75mg/kg225mg/kg图 3 食蟹猴静脉注射SM03嵌合抗体后CD22标记阳性细胞率的变化 杰华生物杰华生物免免疫疫细胞细胞表表型检测举例型检测举例疫表疫表 CD4/CD8比例1 61.81.21.41.6C0 60.81CD4/CD8比0.20.40.6比例0 对照组低剂量中剂量高剂量图 4 猕猴iv 4周 LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例 杰华生物杰华生物免疫细胞表型检测举例免疫细胞表型检测举例免疫细胞表型检测举例免疫细胞表型检测举例 NK标志物比例25253030151520202525101015
16、150505药前药前4 4周周1313周周药前药前4 4周周1313周周图5 药物增加猴外周血CD16阳性细胞比例图5 药物增加猴外周血CD16阳性细胞比例杰华生物杰华生物免疫细胞表型检测举例免疫细胞表型检测举例免疫细胞表型检测举例免疫细胞表型检测举例 抗体水平引自Tox Sci 2008引自Tox Sci,2008 杰华生物杰华生物免疫毒性试验结果分析免疫毒性试验结果分析免疫毒性试验结果分析免疫毒性试验结果分析统计学意义与生物学意义统计学意义与生物学意义（尤其单指标尤其单指标） 统计学意义与生物学意义统计学意义与生物学意义（尤其单尤其单一一指标指标） 变化程度变化程度 与剂量与剂量/暴露的关系暴露的关系 与剂量与剂量/暴露的关系暴露的关系 与拟用临床剂量的关系与拟用临床剂量的关系 疗程关系疗程关系疗程
