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1、单倍体细胞培养,BY 吕菲,一、引言,二、单倍体如何产生,五、单细胞培养,三、单倍体植株的鉴定和二倍化方法,四、单倍体植物的用途（育种）,单倍体（Haploid）：指具有配子体（gametophyte）染色体数的孢子体(植物个体)(sporophyte)。 单倍体=一倍体？,一、引言,根据物种倍性不同，单倍体可以分为两大类：一类是一倍单倍体,即二倍体物种产生的单倍体；另一类是多倍单倍体,即起源于多倍体物种（如4x、6x）。二倍体(diploid )植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid ）如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x =
2、24 n= x = 12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid如，马铃薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid 如，普通小麦2n = 6x = 42， n = 3x = 21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28,单倍体植株特点：,单倍体含有本物种配子染色体数及其全套染色体组，也就是有生活必需的全套基因，因此在适宜条件下，能正常生长。但因为所含染色体仅是正常体细胞的一半，一般表现为： 一般比较
3、矮小纤弱，各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代； 染色体一经加倍，即得到纯合的正常植物体。,体内发生,离体诱导,二、单倍体植株如何产生,体内发生：体内发生 即从胚囊内产生单倍体。这包括：雌核发育：精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传控制下进行雄核发育：卵子与正常的精子受精，进入卵子内的精子染色体加倍，发育为完全为父本性状的二倍体,（1）人工诱导雌核发育的方法,精子遗传物质的失活（假受精） 辐射处理：射线（通常用60Co或173Cs)，X射线和紫外线 化学处理：甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等 显微手
4、术法：直接除去受精卵中的雄原核。 细胞分裂的阻止（抑制第二极体排出，发育成二倍体） 温度休克法：冷休克、热休克 流体静水压作用： 化学制剂处理：细胞松驰素B、聚乙二醇,（2）人工诱导雄核发育的方法,辐射处理：射线（通常用60Co或173Cs)，X射线和紫外线用紫外线、X射线或射线处理卵子，使其遗传物质失活，与正常精子受精，再在适当时间以冷、热或高压等处理。,离体诱导：植物细胞具有潜在的再生性和全能性,能发育为完整植株，故应用组织培养技术对特定组织进行离体培养，可诱导产生单倍体。方法如下：A、花药和花粉培养B、未受精子房及卵细胞培养,1、概述 概念花药培养: 把发育到一定阶段的花药接种在人工培养
5、基上,使其发育和分化成为植株的过程.花粉培养(小孢子培养): 从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.,A：花药和花粉培养,花药培养和花粉培养是获 是植物单倍体的有效方法之一,2、花药或花粉培养在作物育种中的作用：,（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需1-2年。,花药和花粉培养,二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。,（2）提高了目标基因型的选择效率,AB aB Ab abAB AABB
6、 AaBB AABb AaBb aB aABB aaBB aABb aaBb Ab AabB AabB AAbb Aabb ab aAbB aabB aAbb aabb,花药和花粉培养,二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。,花药和花粉培养,植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。利于筛选隐性突变体 提高诱变效率。,（3）诱变育种中的作用,（4）利于获得优良植株如：芦笋全雄系的培育,（5）用作基础研究的各个领域,花药和花粉培养,2N,N,减数分裂,花药和花粉培养,3、花药和花
7、粉培养中雄核发育的途径,A途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株,花药和花粉培养, B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。,花药和花粉培养,4、花药培养与花粉培养的异同点,培养目的相同，均获得小孢子植株。 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。 花粉
8、培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。,花药和花粉培养,花药和花粉培养,花药培养,被子植物的花药中，细胞按染色体的倍性可分为两类：一类为单倍体细胞，即由花粉中的花粉母细胞减数分裂后形成的小孢子；另一类为二倍体细胞，如药隔、药壁及花丝等组织。,1、研究历史： 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。 花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。 我国花药培养工作虽然开始较晚，但在短短的时间内取得了可喜的进展，1974年中国农科院植物研究所和中国农业科学院烟草研究所，仅仅用了三年的时间，就培养
9、出世界上第一个作物新品种-单育1号烟草品种。,花药培养,2、花药培养的基本程序：,花药培养,挑选适宜的基因型作材料； 确定花粉发育时期；材料的预处理；诱导培养；分化培养； 染色体数观察和染色体数加倍；花粉植株当代及后代观察鉴定。影响花药培养的因素很多，如材料生理状况和基因型、接种时期、接种方式(如直插、或平放)、培养方式(固体、漂浮、液体浅层连续培养、条件培养等)、基本培养基种类、激素、密度效应与条件培养等。,选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。,花药
10、培养,花药预处理大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。,花药培养,花药培养常用的基本培养基：N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物的花药培养B5、MS、White、Nitch 等。C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高 出愈率。,激素：相对较低的激素水平 蔗糖：一般2-3%，高浓度对禾谷类较有利,番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度 2 3 4 6 10 13 17 诱导频率 5 10 12 18 25 45 8,培养条件温度和光照：,花药培养的意义 1.同常规的育种方法相比，利用花药培养可以大大缩短育种年限。 2.利用花药培养的单倍体育种较常规育
11、种便于根据表现型进行选择。 3. 单倍体加倍的纯度，较常规的自交选育出来的自交系纯度要高的多。4.对于自交不亲和的物种可以获得杂交种子。 5.在远源杂交方面具有较大的利用价值。,花药培养,花粉培养,花粉培养：把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。且不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是比花粉培养难度大。,1、取材时期：四分体时期到单核早期。 2、花粉的分离： 3、小孢子纯化： 对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 4、花粉的培养,花粉培养,花粉培养技术,材料的准
12、备： 1）自然散落法(漂浮培养自然释放法) ： 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。,花粉培养,花粉培养方法,1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养： 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养。 4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载
13、玻片形成微室进行花粉培养。,看护培养图解,1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。,花粉植株的形态发生方式,烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株,花粉培养,1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。,四、花粉植株的形态发生方式,花粉培养,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤组织分化形成再生植株,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,水稻花药培养的愈伤化发生途径,花粉单倍体植物的培养程序及其技术关键,花药和花粉培养
14、中的白化苗,影响白化苗形成的因素,花粉发育时期：花药培养中，白花苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高。 培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分化出更多的白化苗 培养温度：当培养温度提高时，白花苗的数目也随之增加。,花药和花粉培养,1、花粉单倍体植株鉴定的理由 1) 体细胞干扰 2) 生殖细胞的自发加倍,三、单倍体植株的鉴定和二倍化方法,2、花粉植株的鉴定方法 1) 形态鉴定 2) 细胞学鉴定 3) 杂交法鉴定 4) 分子标记鉴定,花粉粒着色鉴定原理：凡有活力的种胚在呼吸作用过程中都有氧化还原反应 , 而无活力的种胚则无此反应。当 TTC (2，3，5-氯化或溴化三苯基四氮唑简称四
15、唑)溶液渗入种胚的活细胞内 , 并作为氢受体被脱氢辅酶上的氢还原时 , 便由无色的 TTC 变为红色的三苯基甲 (TTF) ，从而使种胚着色。当种胚生活力下降时 , 呼吸作用明显减弱 , 脱氢酶的活性亦大大下降 , 胚的颜色变化不明显 , 故可由染色的程度推知种子生活力强弱。,单倍体植株如何加倍, 自然加倍（花粉植株并不象预期都是单倍体） 人工诱导加倍（如：秋水仙素处理） 从愈伤组织再生二倍体植株（单倍体植株再组培，诱导形成愈伤组织，经继代培养后，转化到分化培养基上，由此获得的再生植株，将会有染色体加倍的植株）,草莓花药愈伤组织,草莓花药再生植株,草莓花药植株（染色体加倍）, 胚 胚乳 胚珠
16、子房,B、未受精的子房和卵细胞培养, 由未授粉子房培养产生的单倍体植株来源和发育途径多种多样,B、未受精的子房和卵细胞培养,有助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体卵细胞、助细胞、反助细胞均可发育产生单倍体非正常发育的大孢子四分体产生单倍体,四、单倍体植物的用途（育种）, 大大缩短育种周期 有利于远缘杂交新类型的培育和稳定 与诱变育种相结合可加速育种进程 可作为外源基因转化的受体系统,大大缩短育种周期,常规杂交育种法和单倍体育种法遗传模式图,46年,如花粉培养仅需12年,前言使用单细胞系统比使用完整的器官或植株有更大的优越性。使用游离细胞系统时，可以让各种化学药品和放射性物质很快作用于细胞，又能很快停止作用。通过单细胞克隆，可以将微生物的遗传学技术应用于高等植物的作物改良。,五、单细胞培养,1、 单细胞的分离,由完整的植物器官分离单细胞 a. 机械法将植物叶片放入研钵中 加入研磨介质轻轻研磨 匀浆用纱布过滤 在研磨介质中低速离心 分离出具光合活性和呼吸活性的叶肉细胞。,
