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1、溶血性贫血常用的实验室检查 (hemolytic anemia HA),一、定义(definition),RBC寿命缩短、破坏过多或加速，超过骨髓造血代偿能力引起的贫血。(正常骨髓有6-8倍的代偿能力) 骨髓代偿未引起贫血溶血性疾病,二、分类(classifition),（一）按病因分类先天遗传性 红细胞内在缺陷后天获得性 红细胞外在因素（免疫与非免疫）,(二)按溶血发生部位分（RBC破坏场所）,血管内溶血：急性溶血,红细胞,破坏（血循环中）,游 离 血 红 蛋 白,结合珠蛋白,血红蛋白尿,含铁血黄素尿,高铁血红蛋白 白蛋白,血红蛋白尿,含铁血黄素尿,返回,Hb尿,含铁血黄素尿,血管外溶血：慢
2、性溶血,红细胞,破坏（脾脏）,血红素,珠蛋白,三 、实验室检查 (laboratory features),（一）溶血性贫血的筛查检测,有关红细胞破坏增加的检查（1） 血浆游离Hb测定（敏感）正常值：50mg/L 意义:血管内溶血时明显增加（60650mg/L）,（2） 血清结合珠蛋白测定（Hp）,正常值：0.71.5g/L 溶血存在时，Hp减少。,（3） RBC寿命测定,正常值：2532天 51Cr同位素标记，半衰期15天，说明有溶血存在。,（4）Hb尿测定,（5）尿含铁血黄素试验（Rous test),（六）血浆高铁血红素清蛋白检测：正常人： 阴性阳性：严重血管内溶血。 生化法光谱仪观察在
3、558nm处有一吸收光带 电泳法出现一条高铁血红素清蛋白带,2. 红细胞代偿性增生的检查,血象 见图 网织红细胞计数（无特异性） 正常：0.51.5%,绝对值（2484）109/L 溶贫时达525%甚至75%以上。骨髓象 见图,Cabots ring,多色性红细胞,Howell-Jolly body,嗜碱点彩红细胞 返回,骨髓象,（二）红细胞膜缺陷性的检测,细胞变球形，体表面积和内容物相等,易破坏 膜离子通道异常，钠内流增加。 红细胞膜上的蛋白（膜蛋白带、1、 2、收缩蛋白、骨架蛋白、功能蛋白 ）的数量或结构发生变化，出现形态和功能异常，发生溶血性贫血。,遗传缺陷遗传性球形、椭圆形、口形红细胞
4、增多症。细胞在脾脏清除，属于血管外溶血。 后天获得性红细胞膜缺陷阵发性睡眠性血红蛋白尿, 膜上糖化肌醇磷脂（ GPI ）锚连蛋白异常。为慢性血管内溶血。,膜脂质丢失 = 变形能力下降 = 脾清除率增加,Normal,Hereditary spherocytosis,细胞膜,细胞骨架,红细胞膜缺陷的检验,红细胞渗透脆性试验,RBC孵育渗透性试验,自身溶血试验及纠正试验,RBC渗透脆性试验 检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力,等体积的血液加入一系列的低渗NaCl溶液中;达到平衡; 高速离心并测定光密度. 大多数正常RBC在NaCl浓度约 0.50%时开始结构破坏. 当盐浓度进一步降低 渗漏和溶
5、血增加.,正常渗透脆性,HS时低渗溶液中的 异常溶血,参考值 开始溶血：0.42%0.46%（4.24.6g/L）NaCI完全溶血：0.28%0.34%（2.83.4g/L）NaCI,临床意义 开始溶血0.50、完全溶血0.38 为脆性增高 （1）脆性增高 遗传性球形红细胞增多症（2）脆性减低 小细胞低色素性贫血：海洋性贫 血、缺铁性贫血,(2)红细胞孵育渗透脆性试验原理 37孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀脆性增高 。 参考值 未孵育 50%溶血44.45%孵育 50%溶血4.655.9% 意义 脆性增高 遗传性球形红细胞增多症脆性减低 缺铁性贫血 珠
6、蛋白生成障碍性贫血,(3)自身溶血试验及其纠正试验,红细胞在37孵育48小时，其间由于膜异常引起钠内流倾向明显增加，ATP消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引起ATP生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。,在孵育时，加入葡萄糖或ATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。 正常人轻微溶血，溶血度3.5%； 加葡萄糖、ATP溶血明显纠正， 溶血度5% ，多者可50% G6PD缺陷 ： ATP：可纠正但不能纠至正常G： 同上PK缺陷 ： ATP：可纠正G： 不纠正,（2） 高铁血红蛋白还原试验,G6P 6-PGA 核酸-5-磷酸,NADPH是高铁血红蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的辅酶
7、。 G6PD缺陷 NADPH减少时，高铁血红蛋白和谷胱甘肽还原下降。,参考值：高铁血红蛋白还原率75%高铁血红蛋白0.3-1.3g/L G6PD缺陷高铁血红蛋白还原率明显下降,（3）变性珠蛋白小体生成试验,受检RBC乙酰苯肼 作活体染色（甲基紫） 有变性珠蛋白小体，则膜上形成紫黑色颗粒计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率 正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般小于30% 见图,3712h,G6PD缺乏症常高于45%，故可作为G6PD缺乏的筛检试验。 还原型谷胱甘肽缺乏症也增高。 不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%84%。 HbH病和化学物质中毒时也增高。（ G6PD缺乏症，NA
8、DPH减少时，红细胞内还原型谷胱甘肽减少，高铁血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体）,Heinz Body Haemolytic Anaemia,G6PD deficiency is the most common enzymopathy causing hereditary haemolytic anaemia.,咬合形细胞 、 盔形红细胞,水泡细胞Blister cell,Heinz bodies,G6P 6-PGA 核酸-5-磷酸,NADPH在紫外线照射下会发出荧光 NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。 正常人有很强荧光,酶活性为（
9、4.971.43）U/gHb G-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光 杂合子或某些G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光,(4)G6PD荧光斑点试验和活性测定,(5) PK荧光斑点试验和活性测定,标记荧光于NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD 正常人PK活性斑点在20钟内消失,酶活性15.11.99 U/gHb 荧光斑点不消失或时间延长说明PK活性缺乏 中间缺乏（杂合子）时，荧光25min60min消失 严重缺乏（纯合子）时，荧光60min不消失。,PEP,PK,ADP,ATP,丙酮酸,LD,NADH,NAD,乳酸,（四）珠蛋白合成异常的试验,血红蛋白由珠蛋白和血红素构成，珠蛋白分子
10、由两对肽链组成，一对是链，另一对是非链（、），正常成人血红蛋白有3种：HbA(22)、HbA2(2 2)、HbF(2 2)。珠蛋白异常分为两大类，一类是某个肽链合成量减少，即地中海贫血（ ），另一类是多肽链的结构发生质的改变，即异常血红蛋白病。,（1）血红蛋白电泳检测：醋酸纤维膜电泳法，检查有无异常血红蛋白区带 诊断海洋性贫血地中海贫血,异常HB带,+,醋酸纤维蛋白膜电泳,临床意义： HbA2：-地中海贫血。恶贫、巨贫轻度。 HbA2：缺铁、铁粒幼红细胞贫血。 （2）胎儿HB酸洗脱试验 HbF抗酸能力较强，不易被酸洗脱。 血片置酸性缓冲液保湿一定时间。含HbF的红细胞不被洗脱，再用伊红染色呈鲜
11、红色 成人1%，地中海贫血轻型少数RBC呈阳性，重型阳性RBC明显增多。,（3）胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验 在碱性溶液中， HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中易变性沉淀，测定滤液中Hb含量，即HbF含量。 成人2%，新生儿5585%, 1岁左右同成人 增高：地中海贫血明显（8090%）。急性白血病、再障、红白血病、淋巴瘤轻度。 （4）HbA2定量测定：1.13.2% 临床意义同Hb电泳,（5）限制性内切酶谱分析：意义：Hb病的基因诊断。,（五）自身免疫性溶血性贫血检测 autoimmune hemolytic anemia AIHA,自身免疫性溶贫（AIHA）：是体内免疫发生异常
12、，产生自身抗体或（和）补体。结合在RBC膜上， RBC 易被单核巨噬细胞系统所吞噬，RBC破坏加速而引起一组溶血性贫血。,（1）抗人球蛋白试验 ( Coombs) 原理 直接抗人球蛋白试验： 自身免疫性溶血性贫血（AIHA）血清中有抗自身红细胞的不完全抗体，他与表面附有相应抗原的红细胞结合，成为致敏红细胞，加入抗人球蛋白与红细胞表面不完全抗体结合，使红细胞相互连接起来出现凝集现象。来证实红细胞表面有不完全抗体。抗人球蛋白直接试验阳性；间接抗人球蛋白试验 ：检查血清中有无游离的不完全抗体，敏感性差。,抗人球蛋白,IgG不完全抗体,RBC,直接抗球蛋白试验（DAT） 阳性（右）,临床意义 正常人抗
13、人球蛋白试验直接、间接均阴性， 自身免疫性溶血性贫血阳性（主要见于温抗体型 ，在37条件下作用最强 IgG）,(冷抗体型 4条件下进行试验 IgM) 新生儿同种免疫溶血病、SLE、RA、HD、NHL 可阳性。,（2）冷凝集素试验 原理：冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身RBC、“O”型RBC或与患者同型RBC发生凝集，当温度升高时，凝集块又复消失。 参考值：效价1：40，适合温度4。 临床意义：某些AIHA病人效价很高（达64000或更高）。,（3）冷热双相溶血试验：原理：阵发性寒冷性Hb尿症（PCH）病人血清中有双相溶血素，在04 时，溶血素与RBC结合，并吸附补体，但不溶血；当升高至3037则发生溶血。 临床意义： 阳性：见于PCH；麻疹、水痘、流行性腮腺炎，传染性单核细胞增多症。,（六）阵发性睡眠性Hb尿症检测 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria PNH),PNH是红细胞膜的获得性缺陷引起的对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血，临床表现以与睡眠有关的、间歇发作的血红蛋白尿为特征，可伴有全血细胞减少或反复血栓形成。,（ 1）酸溶血试验 (Ham) 原理：红细胞+弱酸血清（pH6.66.8） 37 1小时 红细胞膜对补体敏感， 备解素作用下溶血。,
