免疫组化技术总结

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1、丁香园论坛现任版主丁香园论坛现任版主 wh2008的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ）的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ） 安徽医科大学安徽医科大学 2010.07.16 wh2008 版主版主免疫组化经历介绍免疫组化经历介绍 我是 2006.08 进入丁香园论坛，当时主要是查找文献来的（从低分区-高分区-骨干战友求助区，我查到了很多自己急需的文献）。后来经过一段时间的浏览和学习，发现丁香园论坛还是一个以实验技术交流为主的地方，正好在本课题组建立免疫组化试验方法，于是在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级初级查找资料和摸索方法；中级查找资料和摸索方法；中级问题

2、求助和不断总结；高级问题求助和不断总结；高级难题解答和经验分享难题解答和经验分享。 2008 年 12 月，我在形态版的一个汇总贴【原创】我的免疫组化历程（已上了首页flash和加入为数不多的丁香通实验技术精彩专题），让我的免疫组化经历得到了进一步的升华。在论坛内我目前共得到 13 个精华帖， 其中有 7 个是关于免疫组化方面的(有免疫组化全园资料整理、 经验和教训总结、亲身案例讲述、难题集锦等等，多是原创经验和心得体会)。 今年，我给研究生上“免疫组化试验课”，从实验中发现许多研究生的确是免疫组化“新手”，他们只注重如何做和最终的结果， 但对为什么这样做不太感兴趣。 这在平时带研究生做组化试

3、验也发现他们一旦按照我之前摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后， 他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了， 结果不求上进， 更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了。 当然，免疫组化对于我来说还不能说什么都知道，其实肯定有不懂的问题，只不过我做的多了、失败多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的诀窍，拿来与大家进行分享。此外，个人经验不可能面面俱到，还需要更多有经验的战友加入分享、纠正和补充。让我们一起来打造丁美好的香园论坛免疫组化精彩专题更新啦！ 个人免疫组化感悟（最新原创）个人免疫组化感悟（最新原创） 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？方法操作不难

4、，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做， 这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。 如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有 4 度、室温、37 度，我推荐4 度最佳，反应最温和，背景较浅；而 37 度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、

5、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下， 分析最为准确， 这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 1丁香园论坛现任版主丁香园论坛现任版主 wh2008的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ）的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ） 安徽医科大学安徽医科大学 2010.07.16 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对

6、照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发 SCI 论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难， 加一些形态学数据或图片， 老外十分欢迎， 可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切

7、片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手实验方法需要动手+动脑。动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍一、概念和

8、常用方法介绍 1、定义、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理， 组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合， 再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分， 在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发

9、生的抗原抗体反应产物， 从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类、分类 1） 按标记物质的种类， 如荧光染料、 放射性同位素、 酶 （主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶） 、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2丁香园论坛现任版主丁香园论坛现任版主 wh2008的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ）的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ） 安徽医科大学安徽医科大学 2010.07.16 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按

10、结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中 SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。 它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原， 在荧光显微镜下观察。 当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，

11、从而可确定组织中某种抗原的定位， 进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜， 对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。 免疫酶标技术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进

12、和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有 ABC 法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。 3）免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。 胶体金是指金的水溶胶， 它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为探针， 就能对组织或细胞内的抗原进行定性、 定位， 甚至定量研究。 由于胶体金有不同大小的颗粒， 且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。 由于胶体金本身呈淡至

13、深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 5、被检测的物质、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激3丁香园论坛现任版主丁香园论坛现任版主 wh2008的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ）的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ） 安徽医科大学安徽医科大学 2010.07.16 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 6、特点、特点 1）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（kera

14、tin）显示上皮成分，LCA 显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。 2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于 ABC 法或 SP 三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。 3）定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位， 因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察， 这样就可以进行形态与功能相结

15、合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。 7、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA 的异同的异同 1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。 与免疫组化技术相比， 定量可能更加准确； 当然 Western blotting 也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结

16、合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。 实验流程简介实验流程简介 一、一、SP 三步法三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水。 2）0.3%或 3%H2O2 去离子水（无色液体）孵育 10-30 分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。 3）蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟 4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议 30 分钟内 4 次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用 3 分钟3 次. 5）血清封闭：室温 15-30 分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。 4丁香园论坛现任版主丁香园论坛现任版主 wh2008的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ）的免疫组化总结（下载需要注明来源，谢谢合作！ ） 安徽医科大学安徽医科大学 2010.07.16 6）滴加适当比例稀释的一抗，37孵育 23 小时或 4过夜（最好复温）。PBS 冲洗，3 分钟5 次。 7）滴加生物素标记的二抗，室温或 37孵育 30 分钟-