蛋白质组学技术

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1、蛋白质组学技术,李 明 临床生物化学教研室,一、前言,人类基因组序列图谱初稿的公布，在揭示基因组的精细结构的同时，也凸现出基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂性和多变性之间存在着巨大反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的，这也使得人们对于生命活动的直接执行者蛋白质的重要性有了更深刻的理解，因此，对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面和深入的研究，成为生命科学研究的追切需要和重要任,务。一个以“蛋白质组” （proteome）为研究重点的生命科学新时代已悄然到来。 二、蛋白质组

2、学的概念及其发展史 随着后基因组时代的到来，蛋白质组研究越来越受到国内外科学工作者的密切关注，并以其特有的思维方法和技术手段在解决生物学重大问题上开始显示出强大威力。可以相信，随着蛋白质组研究的不断深入，它在揭示生长、发育、凋亡、分化、信号传导和代谢调控等生命活动的规律上将会有新突破，对探讨重大疾病的发生机制、疾病的诊断防治和新药开发将提供重要的理论基础。,（一）蛋白质组学的概念 “蛋白质组”一词的英文是PROTEOME，它由PROTEins和genOME两个词组合而成，意思是proteins expressed by a genome，即基因组表达的蛋白质。广义上讲，蛋白质组（proteom

3、e）是指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。它是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。由于同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同，即使是同一细胞，在不同的发育阶段、不同的生理条件甚至不同的环境影响下，其蛋白质的存在状态也不尽相同。因此，蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体。,蛋白质组学（proteomics）是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质功能与细胞生命活动规律。要对“全部蛋白质”进行研究是非常困

4、难的，“功能蛋白组学（functional proteomics）”的提出解决了这一难题，其研究对象是功能蛋白质组，即细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质，它是介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学研究之间的层次，并把目标定位在蛋白质,群体上，这一群体可大可小，从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体，以便将来把多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。功能蛋白质组学的研究为实际运作带来方便，人们可利用现有的技术手段来研究蛋白质组这一极限群体中的各蛋白质功能亚群，从理论和技术上使以“全部蛋白质”为研究对象的蛋白质组学这

5、一抽象概念具体化，使研究者们更易于从时、空、量效方面动态、整体、深入地研究生理状态下同一组织细胞在不同发育阶段或同一组织细胞在不同个体间或同一基因组在不同组织细胞间，以及病理情况下同一,疾病的不同发展阶段的蛋白质表达模式和功能模式的变化，揭示一些重要的生命现象和一些重大疾病的发生发展规律。狭义上讲，蛋白质组是指不同条件下细胞内蛋白质的变化，比如正常细胞和异常细胞之间，细胞用药和不用药之间的蛋白质表达谱的差别，这在疾病研究和药物筛选上很有意义，是目前蛋白质组学在应用研究方面最具前景的领域。当然，随着蛋白质组研究的不断发展，蛋白质组学的概念也将不断发展和深化。 （二）蛋白质组学的产生与发展 20世

6、纪中期以来，随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空,间结构的X射线解析，开始了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的主要体现者蛋白质的研究，成为生命科学研究的主要内容。20世纪90年代初期，美国生物学家提出并实施了人类基因组计划，经过各国科学家多年的努力，人类基因组计划取得了巨大成绩，一些低等生物的DNA序列已被阐明，人类DNA序列的框架图已经测定，迄今已测定的表达序列标签（EST）几乎覆盖了人类所有基因。在这样的形势下，生命科学已进入了后基因组时代。在后基因组时代，生物学研究的重点已从揭示生物所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。这种转向,的第一个标志就是产生了一门称为功能

7、基因组学的新学科。功能基因组学的主要任务是解析和综合大量的遗传信息，阐明基因遗传信息与人类生命活动之间的联系。基因的功能是通过其产物mRNA和蛋白质来体现的。近年来利用基因表达连续分析（SAGE）、微阵列（microarray）和DNA芯片（chip）等新技术研究mRNA水平上的基因活动规律取得了较大进展。但mRNA水平的基因表达状况并不能完全代表蛋白质水平的状况， mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4-0.5，蛋白质才是生命功能的主要执行者，由于它存在着翻译后的加工修饰、转移定位、构象变化、,蛋白质与蛋白质及蛋白质与其他生物大分子相互作用等自身特点，因此难以从DNA和mRNA水平得到解答，

8、从而促使人们从组织或细胞内整体蛋白质的组成、表达和功能模式去研究生命活动的基本规律。自1994年澳大利亚学者Williams和Wilkins首先提出与基因组相对应的“蛋白质组”概念，并开始从整体蛋白质水平研究生命现象以来，蛋白质组研究在国际上进展十分迅速，不论是基础理论，还是技术方法，都在不断地进步和完善。许多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层不出穷，众多的制药厂和公司在巨大财力的支持和商业利益的诱惑下,纷纷加入蛋白质组研究领域，蛋白质组研究的文章每年成倍增长。1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia proteome analysis fa

9、cility, APAF）。在政府部门的大力支持下，丹麦、加拿大也先后成立了蛋白质组研究中心。1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议，预测21世纪生命科学的重心将从基因组学转移到蛋白质组学，为生命科学和医药学领域的研究带来了新的生机。1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议，参加者大都来自各大药厂和公司。1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议。1999年5月在日本召开的,国际电泳会议上，约1/3的文章与蛋白质组有关。目前，中国国家自然科学基金委员会关于蛋白质组重大项目的研究已启动，肿瘤蛋白质组研究也已列入我国973和863项目。中国科学院上海生物化学研究所、中国军事医

10、学科学院、湖南师范大学、中南大学湘雅医学院等单位相继开展了蛋白质组学研究。1998年在中国科学院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会，并在此基础上，提出了功能蛋白质组学的研究战略。可以相信在不久的将来，“人类蛋白质组计划”必将启动，而且规模比“人类基因组计划”更大，产生的影响更久远，将是继基因组研究之后的又一“大科学”。,三、蛋白质组学技术方法概述 蛋白质组学主要涉及有两方面的内容：一是研究蛋白质组的组成成份，即蛋白质组表达模式的研究；二是研究蛋白质组的功能，即蛋白质组功能模式的研究，目前主要集中在蛋白质组表达模式方面。蛋白质组表达模式研究的支撑技术主要有双向凝胶电泳和以质谱为

11、代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。 双向凝胶电泳（2-DE）技术于1975年由OFarrell等创立，其原理是第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦（IEF），再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯,酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。等电聚焦电泳由最初的载体两性电解质管胶电泳发展到目前的固相pH梯度（IPG）凝胶电泳，由于采用了IPG胶条从而避免了因载体两性电解质引起的聚焦时间延长、pH梯度不稳定、阴极漂移等现象。目前IPG双向凝胶电泳的分辨率达到了1万多个蛋白质点，但对过于偏酸或偏碱、高分子质量、极微量蛋白质以及难溶性蛋白质的分辨仍感困难。由于双向凝胶电泳对批量蛋白质可实现一次性分离，

12、具有高灵敏度的高分辨率、便于计算机进行图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，因而成为目前分离蛋白质组分的核心技术。此外，双向高效柱层析、毛细管电泳也是分,离蛋白质组分的有效技术。 对分离的蛋白质进行鉴定是蛋白质表达模式研究的又一重要内容，通常采用的有蛋白质微量测序、氨基酸组成分析等传统的蛋白质鉴定方法，但这些方法费时、费力、不易实现高通量分析。因此一种新的蛋白质鉴定技术质谱（MS）法受到了人们的重视和应用，其基本原理是样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子质量。质谱在20世纪初就已经产生，多用于无机物或小分子有机物的鉴定，直到80年代末随着“

13、软电离”技术的出现而进入生物大分子（如蛋白质）的鉴,定领域。所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。软电离质谱用于大分子的鉴定，主要有以下特点：灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子质量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用，如用HPLC/MS来分析复杂体系。目前用于蛋白质鉴定的质谱主要有两种：电喷雾质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。但要精确鉴定某一蛋白质通常还得联合几种鉴定技术。最近，国处建立了一种将MALDI-MS技术直接用于组织切片或印片的方法（Pierre C et al, 1999）

14、，即组织切片或印片原位质谱分析技术，取得了较,满意的结果。 生物信息学是随着人类基因组计划、计算机技术、网络技术的发展而诞生的一门新兴学科，是蛋白质组学的一个重要的技术平台。生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分，其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用：一是构建和分析双向凝胶电泳图谱，二是数据库的搜索与构建。目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。NRDB由SWISS-PROT和GENPETP等几个数据库组成。 蛋白质功能模式的研究是蛋白质组研究的最终目标，其主要研究目标是要揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协,调的关系。并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与

15、蛋白质结构功能的关系。目前，蛋白质功能模式研究的主要技术有酵母双杂交系统、噬菌体展示、生物传感芯片质谱、基因工程和蛋白质工程中的突变表达分析、磁共振成像、X线晶体衍射分析、蛋白质芯片技术等。 四、蛋白质样品制备技术 蛋白质组是指某种细胞或组织中基因组表达的全部蛋白质。实践中更多的情况是研究功能蛋白质组，即细胞在某一特定阶段或某一生理状态下基因表达的所有蛋白质。由于蛋白质组研究是对不同时间和不同空间发挥功能的蛋白质整体的研究，因此如何从细胞组织中尽可能完整地将蛋白质以溶解状态提取出来，是蛋白质组研究的首要步骤。,（一）蛋白质制备常用技术 在蛋白质制备中主要包括细胞组织的破碎裂解；蛋白质增溶溶解以

16、破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。 离液剂、还原剂及表面活性剂的选择 （1）离液剂（chaotropes） 最普遍的离液剂是脲，脲的作用主要是改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质的肽链伸展开来，充分暴露疏水,中心，降低接近疏水残基的能量域，但通常当脲和表面活性剂CHAPS联合使用时，会使某些蛋白质吸附在固相pH梯度凝胶中而丢失。因此，近年常将一种新的离液剂硫脲和脲联合使用，以增加蛋白质在IPG胶中的溶解性。硫脲的使用大大改善了蛋白质的溶解性

17、能，特别是改善了膜蛋白的提取。但硫脲在水中溶解性差，需用高浓度的脲助溶。 （2）表面活性剂 蛋白质在去折叠后，会暴露出大量疏水性残基，因此常需使用表面活性剂破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用。常使用的表面活性剂有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂,Triton X-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS等。 （3）还原剂 在蛋白质制备中常需要断裂蛋白质分子中的二硫键，以利于肽链的分离，因此样品还原的好坏也会影响到蛋白质的分离效果。一般使用-疏基乙醇和二硫苏糖醇（DTT）作还原剂，但DTT本身带有电荷，在等电聚焦时，常常会迁移到pH范围以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉淀下来。采用非离子型还原剂如三丁基膦（TBP）可大大增加蛋白质的溶解性，并可帮助蛋白质从第一向转移到第二向。,