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1、大肠杆菌,葡萄球菌,在缤彩纷呈的生物界，微生物似乎显得过于微小与沉寂。然而，它们在自然界却作用非凡。微生物有哪些种类呢？,(细菌、蓝藻、支原体、放线菌),(酵母菌、霉菌、大型真菌),(草履虫、变形虫、疟原虫),(噬菌体、艾滋病毒),形体微小，结构简单,通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物。,微生物：,微生物基础知识,SARS病毒、 禽流感病毒,1、病毒,病毒的增殖：,2、细菌,细菌：单细胞不分枝的原核微生物。 细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察,大肠杆菌,葡萄球菌,细菌的构造,图1-3 细菌的结构,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢
2、。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,3、真菌,霉菌,酵母菌,大型真菌,霉菌生殖方式,孢子生殖,孢子是一种有繁殖能力的生物组织,并且具休眠作用,能在恶劣的环境下保持自有的传播能力,并在有利条件之下直接发育成新个体。,原生生物,想一想,这些肉眼看不到的微生物是怎样获得呢？,课题1 微生物的实验室培养,专题2 微生物的培养与应用,一、基础知识,二、实验操作,三、结果分析与评价,四、课题延伸,一、基础知识：,（一）培养基,人们按照微生物
3、对营养物质的不同需求,配制出其生长繁殖的营养基质。,(加入凝固剂琼脂),固体培养基：菌落,菌落：,单细胞或数个同种类的微生物在固体培养基上大量繁殖时，所形成肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。,3.培养基中的营养物质:,(提供碳元素的物质),(提供氮元素的物质),在提供上述几种主要营养物质的基础上,培养基还需满足微生物生长对PH、特殊营养物质及氧气的要求。,（二）无菌技术,1.无菌操作：,泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,无菌技术主要包括：,1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。,2、将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基的进行灭菌。,3、为避免周围环
4、境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。,4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。,思考：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。,2.消毒与灭菌,（1）消毒：,（2）灭菌：,使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，
5、煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌,孢子,细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用酒精擦拭双手;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,1、灼烧灭菌：2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,(2)灭菌的方法：,接种环、接种针、试
6、管口等,玻璃器皿、金属用具等,培养基、无菌水等,思考：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过
7、。,二、实验操作,(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,本实验用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，可分成制备培养基和纯化大肠杆菌两个阶段进行。,（二）纯化大肠杆菌,二、实验操作,(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,二、实验操作,(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,、计算： 、称量： 、溶化： 、灭菌： 、倒平板：,1、制备培养基,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL,（1）计算,根据下列培养基配方比例，计算配置100mL培养基时，各成分的用量。,（2）称量,牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。,蛋白胨,牛肉膏,用玻璃棒挑取牛肉膏,（3）溶化,加水加热熔化
8、牛肉膏；加入蛋白胨和氯化钠继续加热；加入琼脂；用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。,（4）灭菌,一是棉塞能防止杂菌污染； 二是保证通气良好,为什么不是密封而是加棉塞？,思考：,将配制好的培养基转移至锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用几层旧报纸包紧， 58套培养皿作一包，包好后放入干热灭菌箱灭菌，在160170 下灭菌2h 。,待培养基冷却500C左右时，在酒精灯火焰附近（无菌区）倒平板。,讨论：1.用什么方法估计培养基的温度为500C？,可以用手触摸盛有
9、培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行到平板了,、倒平板：,、将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。,倒平板的操作过程：,、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。,倒平板的操作过程：,讨论：2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌防止瓶口微生物污染培养基.,、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约1020mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。,倒平板的操作过程：,4、等待平板冷却凝固（大约510分钟）后将平板倒过来放置，使皿盖在下、皿底在上。,倒平板的操作过程：,讨论：3.平板冷凝后，为
10、什么要将平板倒置？,答：平板冷却后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。,讨论：3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,1. 培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,2. 为什么需要使锥形瓶的瓶口
11、通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3. 平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4. 在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,2、纯化大肠杆菌,（1）平板划线法,平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次
12、划线后培养，可以分离到有一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。,不同的平板划线法,培养基表面的单菌落,1. 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2. 在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却
13、后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3. 在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（2）稀释涂布法,稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,稀释涂布法,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合
14、适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等。,讨论,四、结果分析与评价,1、培养基的制作是否合格,2、接种操作是否符合无菌要求,3、是否进行了及时细致地观察与记录,五、课题延伸,菌种的保藏,斜面保藏,目的：保持菌种的纯净,方法： 斜面保藏法 甘油管保藏法,（二）纯化大肠杆菌：,平板画线法,稀释涂布平板法,微生物接种方法：,斜面接种法,穿刺接种法,核心：,都是要防止杂菌的污染,保证培养物的纯度。,（二）纯化大肠杆菌：,平板划线法:,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞
15、群体,这就是菌落。,结果:,平板划线操作：,1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。,2、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。,图1,图2,4、将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。,3、将试管口通过火焰。,平板划线操作：,图3,图4,5、将试管口通过火焰并塞上棉塞。,平板划线操作：,6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。,图5,图6,7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。,平板划线操作：,
16、8、将平板倒置，放入培养箱中培养。,图7,图8,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（二）纯化大肠杆菌：,稀释涂布平板法:,
