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1、胡付品 华山医院抗生素研究所,临床微生物在细菌耐药控制中的重要作用,临床医生的要求,有明显感染症状但细菌培养结果呈阴性 培养并报告的细菌不是目标病原菌 药敏试验报告的抗菌药太少，或本院已不用 需要用的药物却没有做药敏试验 药敏结果显示敏感，但临床疗效差 细菌室不能提供相关指导,微生物室人员的要求,标本采集过程或步骤不正确 有些病原菌生长营养要求高，或生长周期长 不是所有细菌都能做药敏试验 不是所有药物都能做体外药敏实验 不是所有细菌或所有药物都有判断标准 临床医生不主动联系实验室人,临床微生物人员,临床医生,不沟通引发的抱怨,恶性循环的后果,临床医生 不愿意做病原学检查 抗菌药物滥用 催生细菌
2、耐药性的上升 临床微生物 进一步不了解临床 不能更好的为临床提供有力的支持,主要内容,正确的标本采集 规范的药敏试验 常规检测 特殊耐药菌株检测 少见耐药表型结果解读 及时准确的细菌耐药监测报告,巧妇难为无米之炊,标本采集的原则,容器必须无毒性 避免正常菌群的污染 选择正确的标本采集部位 采用正确的操作方法 厌氧培养的标本不能冷藏 标本量要足够 假阴性 信息记录,标本运送原则,所有标本最好在2小时内送往实验室 一般而言，保存标本不超过24小时 环境敏感菌不能冷藏 淋病奈瑟菌 脑膜炎奈瑟菌 流感嗜血杆菌,痰标本的采集和运送,采集时间：使用抗生素前 采集方法： 自然咳痰：必须用清水彻底漱口，用力咳
3、痰，于灭菌容器中或输送培养基中。 支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议直接种入输送培养基 痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能作厌氧培养。,注意事项,无菌容器 1 mL 最好在2小时内送至实验室 于4保存不能超过24小时,痰培养标本培养前革兰染色,当白细胞大于25个每视野，上皮细胞小于10个每视野时为合格的痰标本。 实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色，当在低倍镜下白细胞小于10个每视野、上皮细胞大于25个每视野时应视为不合格痰标本； 当白细胞小于10个每视野，上皮细胞小于25个每视野时再参照油镜观察标本中细菌分布作出判断,至少检查10个低倍镜视野,不可接
4、受的痰标本,可接受的痰标本,痰标本培养,血平板,麦康凯平板,巧克力平板,痰标本细菌学检查,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,卡他莫拉菌,优势生长的细菌就是致病菌吗？,血液培养的原则-优质的实验室操作,疑似感染患者首次血培养至少一套，包括一瓶需氧瓶及一瓶厌氧瓶。采集后标本如不能及时送检，应置常温保存，不能放冰箱或35-37培养箱。 采血时间：尽可能在使用抗生素前，寒颤和发热初期。 采血量：采一次或采一瓶是错误的 至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血采血注入厌氧瓶。 采血方法：不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。,影响血培养病原
5、菌生长的因素,血量：1:5-1:10 或按厂家规定 培养基中的抗生素吸附剂 树脂 活性炭 液面的气体 需氧瓶：CO2 厌氧瓶：CO2，N2,血培养存在的主要问题,如果皮肤定植的细菌没有被杀死，细菌将通过针头进入血培养瓶并生长 如果不能将真正引起感染的凝固酶阴性葡萄球菌和皮肤定植菌“污染”菌区分开，可能会导致万古霉素的应用,血培养的常见问题,假菌血症 (Pseudobacteraemia)： 病原菌来源于病人血流之外 不正确采血 实验室操作 可产生暴发性，消毒液被菌污染 仪器问题 白细胞过多 过量的血量 其它,污染： 这些菌（阳性杆菌、棒状杆菌、丙酸杆菌、气球菌、凝固酶葡萄球菌、微球菌）也引起全
6、身感染 污染瓶只见于一套瓶中的1-2瓶 只有第二套来鉴别 不作药敏 保留此瓶几天，等待第2套结果,22,标本的收集和运送：瓶数及血量,Cockrill 2004年报告：163位病人，血培养仪,分泌物采集规范,对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。 先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送检。闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等。 采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集。 注意脓液的气味、性状、颜色，注意厌氧菌存在的可
7、能。 不能及时送检应用输送培养基。,注意：表浅标本中的细菌大多已死亡,无菌体液的采集运送规范,无菌采集是培养成功的首要因素 为提高阳性率，可将无菌体液注入血培养瓶。 采集的标本应立即送至临床细菌室，脑膜炎球菌有自溶酶，离体后回迅速自溶。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌离体后极易死亡。 延迟送检时一定不能放冰箱，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等对温度敏感的细菌在冰箱会很快死亡。,尿液采集和运送,正常人膀胱中的尿液是无菌排出时受外尿道中正常菌群污染混有细菌。 采集时机：抗菌药物使用之前的清晨第一次尿液。 采集消毒中段尿，在采集尿液前，须以肥皂和清水洗净尿道口，弃去前段尿，留取中段尿或无菌操作取中段尿于无菌容器中
8、，立即送检。 经尿道排出的中段尿，细菌数不会超过103cfu/ml。 泌尿系感染时，尿中细菌数高于104-105cfu/ml。因而，以此为界作为诊断泌尿系感染依据,不应从集尿袋中采集尿液。 尿液中不应加防腐剂或消毒剂。 若尿液培养前患者曾使用抗菌药物，应反复多次送检。 多次采集或24h尿不应用于尿液培养。 标本采集后应及时送检并接种，室温下保存时间不应超过2h（夏季保存时间应适当缩短或冷藏保存）。如果不能及时运送或接种，应4冷藏，但保存时间也不应超过8h. 除非进行流行病学调查，不应对长期留置导尿管患者常规进行尿液培养。 培养结果应结合临床表现、菌落计数以及微生物种类等，进行综合判断。,尿液采
9、集和运送注意事项,细菌的鉴定,细菌的形态特征 菌落形态、色素 革兰染色阴性、阳性 杆菌、球菌 葡萄状、链状 生化反应特征 氧化酶、触酶 药物敏感性 杆菌肽、奥普托辛 特征现象：卫星现象,主要内容,正确的标本采集 规范的药敏试验 常规检测 特殊耐药菌株检测 及时准确的细菌耐药监测报告,药物敏感性试验定义,测定抗感染药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验，简称药敏试验（Antimicrobial Susceptibility Test，AST）。,为什么要做药敏试验？,无法推测敏感或耐药 病人个体化治疗指南 提供经验治疗的依据 建立当地或国家处方政策 监测流行病学趋势 监
10、测细菌耐药性 测试新抗菌药物的抗菌活性 检测新耐药机制的方法,如何做药敏试验？,定量方法 (MIC, mg/L) 琼脂稀释法 肉汤稀释法 E-test 定性方法 (SIR) 纸片扩散法 自动化仪器,实验室中常用的几种MIC测定方法,肉汤微量稀释法,肉汤(试管)稀释法,（一）规范化的药敏试验方法-扩散法(纸片法),原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，根据抑菌圈的大小判断细菌对抗菌药物的敏感性。,合适的培养基厚度,普通细菌 MH琼脂培养基（MuellerHinton Agar） 培养基厚度：4mm 肺炎链球
11、菌及其他链球菌 5脱纤维羊血MH琼脂培养基 嗜血杆菌属 嗜血杆菌培养基（HTM）SR158添加剂,错误做法：采用血琼脂做肠球菌的药敏试验,正确的接种菌量,扩散法：0.5麦氏浊度（1.5108CFU/ml）,Select colonies,标准浊度,正确的接种菌量,可接受（最低浓度）,理想,可接受（最高浓度）,如何制备菌悬液？,菌落？ 至少3个菌落，为什么？,可能丢失耐药细菌 (携带有耐药质粒的耐药菌株) .,合适的培养条件,需氧菌： 35 2 ，16-18小时 嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时 葡萄球菌：33-35 ，苯唑西林、万古霉素 24小时 肠球菌：万古霉素-24小时
12、溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时,正确阅读结果（纸片法）,工具：游标卡尺，尺子 光源：反射光、透射光 阅读： 药敏平皿背衬不反光的黑色背景用 肉眼观察 也可用机器阅读抑菌圈直径 抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能看到的细小菌落应忽略,阅读结果的正确光源,抑菌圈内有菌落，怎么办？,大肠埃希菌污染有肠球菌 菌落再次纯分,铜绿假单胞菌 有耐药菌落,重要的质控菌,肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922 非发酵菌： 铜绿假单胞菌ATCC27853 葡萄球菌： 金黄色葡萄球菌ATCC25923 肠球菌： 粪肠球菌ATCC29212 肺炎链球菌： 肺炎链球菌ATCC49619
13、 嗜血杆菌： 流感嗜血杆菌ATCC49247,CLSI文件：我国部颁标准,一个细菌一个药一个标准,（二）正确的抗菌药物组合,原则：针对监测细菌设计监测药物的品种和数量 CLSI抗菌药物选择的原则（A、B、C、U组） 根据病原菌的种类 革兰阳性球菌 葡萄球菌、肠球菌 、链球菌等 革兰阴性杆菌 肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等 根据本单位临床实际需要,FDA批准临床微生物室常规药敏试验分组,抗菌药： A .为常规的一级(一线)试验组合并常规报告结果 B. 亦可用于一级(一线)试验，但应选择性报告，即当A组药物耐药时可以选择性地报告B组中的同类药物 C. 为补充性药物，可选择性报告 U. 为补
14、充性药物，仅用于治疗尿路感染的选择用药,46,补充性药物选择性报告的原则,对一线试验组合的药物耐药 身体特殊部位 患者不能接受一线试验组合的药物 一线试验组合的药物对患者无效 复数菌感染 多部位感染,47,肠杆菌科细菌的抗菌药物选择,葡萄球菌的抗菌药物选择,*报苯唑西林的结果,(三)监测菌种的要求,结核分枝杆菌、真菌和厌氧菌不列入耐药监测范围 需监测的临床分离菌必须鉴定到种 葡萄球菌必须明确 MRS MSS 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌应明确产ESBLs的属性 肺炎链球菌必须明确对青霉素的耐药属性 PRSP PISP PSSP,临床重要耐药菌株的检测,细菌主要的耐药机制
15、,灭活酶与钝化酶的产生 抗生素渗透屏障作用 靶位结构改变,细菌代谢状态或营养缺陷 细菌菌膜形成,X,外排,灭活,渗透障碍,靶位改变,耐甲氧西林葡萄球菌的检测,苯唑西林：1g/片 金葡菌 11-12mm 凝固酶阴性葡萄球菌 17mm 4%NaCl- 6g/ml苯唑西林盐平板 培养条件：35，24-48小时 结果：1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株 头孢西丁：30g/片 金葡菌 22mm 凝固酶阴性葡萄球菌 24mm 分子生物学方法：PCR扩增mecA基因,耐甲氧西林葡萄球菌的检测,苯唑西林和头孢西丁检测,苯唑西林盐平板检测,临床意义,D-试验,D试验临床意义,葡萄球菌中的erm基因编码
16、一种改变了的核糖体结构(23S rRNA 的甲基化)，可导致对大环内酯类（如红霉素）和林可霉素类（如克林霉素）耐药。 erm 基因需诱导才能使克林霉素耐药性表达，红霉素具诱导作用。 若出现红霉素耐药，克林霉素敏感，而D试验阳性。如果不进行D-试验检测，克林霉素很可能会被报告敏感而误导临床用药。,HLARE肠球菌的检测,High Level Aminoglycoside Resistant Enterococci HLARE 120 g/片庆大霉素 K-B法药敏 抑菌圈直径 S 10mm I = 7-9mm (需MIC确证)R = 6mm 临床意义 HLARE菌株采用氨苄西林和氨基糖苷类抗生素的联合治疗无效,耐万古霉素肠球菌检测,万古霉素纸片扩散法 含量：30 g/片 结果：透射光，抑菌圈内出现薄雾状或任何其他生长或抑菌圈14mm均表示耐药 抑菌圈15-16mm为中度敏感，MIC 抑菌圈17mm判定为敏感 万古霉素耐药确证试验 含6 g/ml万古霉素的MH平板 1-10 l 0.5麦氏浊度菌悬液 35 ，24小时，1个菌落生长即判定为耐药分子生物学方法：VanA、VanB、VanC 等基因,
