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1、实验、大肠菌群的检验,实验目的,掌握鉴别大肠菌群的方法。掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的方法。,实验原理,大肠菌群指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有否被肠道致病菌污染。食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。,实验设备,恒温培养箱：（361） 显微镜 培养皿 试管、移液管、三角烧瓶、小倒管 天平 载玻片,实验试剂,乳糖胆盐发酵管：20g蛋白胨、5g 猪胆盐及10g乳糖溶于1L水中，校正pH为7 .4，加25ml溴甲酚紫指示液(0.4 g/L)，分装每管20
2、ml, 并放入一个小倒管，115高压灭菌20 min。伊红美蓝琼脂平板：10g蛋白陈、2gK2HPO4及17g琼脂溶解于1L水中，校正pH至7.1，分装于锥形瓶内，121高压灭菌15min。临用时加人10g乳糖并加热溶化琼脂，冷至5055。加人20mL伊红溶液（20g/L)和10ML美蓝溶液（6.5g/L）摇匀，倾注平板。,乳糖发酵管：将20 g蛋白陈和10g乳糖溶于1L水中，校正pH至7.4，加入25mL溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，按检验要求分装，并放人一个小倒管，加热至115高压灭菌15 min灭菌生理盐水：0.9,革兰氏染色液：结晶紫染色液：1g结晶紫溶于20mL95%乙醇，与80m
3、L草酸铵溶液（10g/ L)混合，摇匀。革兰氏碘液：1g碘与2g碘化钾混合后，用少量水溶解，稀释至300 mL。沙黄复染液：0.25g沙黄溶于10ml95%乙醇中，然后用90ml水稀释，混匀。,实验内容与步骤,1）检样稀释（无菌操作）将25mL（或g）检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用800010000r/min的速度处理1 min）制成1：10的均匀稀释液。 用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的稀释液。 另取1mL灭菌试管，按操作依次做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1 mL灭菌
4、试管。,2）乳糖发酵实验接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土1)温箱内培养（24士2) h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。,3）分离培养将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（36士1)恒温箱内培养18一24 h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。,4）证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36士1)恒温箱内培养（24士2) h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。,实验报
5、告,根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠菌群的MPN。,注：本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和0.01 mL (g)。每稀释度3管。 表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和0.1mL(g）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1ML(g), 0.01ML(g）和0.001mL(g）时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。,1.斜线法 2.曲线法 3.方格法4.放射法 5.四格法,附1：平板划线接种方法,附2：革兰氏染色法操作步骤,1、涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。 2、染色：用草酸铵结晶紫染色1min ,用水冲洗
6、。 3、媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。 4、乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5min）。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。,5、复染：蕃红染液复染1min ,水洗。6、吸干并镜检：若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作对照。,步骤：,结果:阳性菌紫色 阴性菌红色,革兰氏染色法（Gram Stain）,细菌经结晶紫初染染成紫色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为紫色。革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经蕃红复染成红色。,大肠杆菌革兰氏染色照片,思考题,1大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何作用？ 2在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存在极微小的气泡，这种情况可否算作产气阳性？ 3造成本实验误差的主要原因有哪些？,
