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1、,同种异体骨移植修复过程中转化 生长因子1表达的实验研究,梁炳生 关海山 山西医科大学第二医院骨科,前 言,转化生长因子1（ TGF-1）是一种多肽类多功能生长因子，可以调节多种细胞或瘤细胞的生长分化，在骨组织中受损伤刺激可启动新生骨与软骨的生成。动物实验证明，外源性TGF-1能够促进骨折愈合。目前认为，TGF-1表达量的变化可直接反映成骨能力的强弱，其基因表达信号的强弱可反映生成量的多少。,本研究采用免疫组化和原位杂交方法，观察分析同种异体骨移植修复过程中，术后时间、移植骨处理以及供受体间主要组织相容性抗原是否相配等因素对移植骨局部内源性TGF-1表达的影响，旨在为进一步研究异体骨移植愈合机
2、理以及临床合理使用重组生长因子提供实验依据。,材料与方法,本研究采用224三因素析因试验设计方法。根据供受体间主要组织相容性抗原是否相配将实验动物随机分为两个大组，即主要组织相容性抗原相配组和不配组。各大组再随机分为两个处理组，分别是新鲜异体骨移植组和冷冻异体骨移植组。,一、实验设计,表1：实验动物分组情况及处理,二、实验动物选择选用健康、成年近交系LEW大鼠 （主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1l）和近交系DA大鼠（主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1a），雄性，体重270-320克。 北京大学医学部实验动物中心提供。,三、移植骨的制备LEW和DA大鼠各12只做为供体。无菌条件下取其双侧股
3、骨，除去骨髓及附着软组织， 修剪成3mm4mm形状规则的半管状皮质骨块，0.9%氯化钠注射液反复冲洗。 将其中24块皮质骨（LEW、DA大鼠股骨各12块）装入双层无菌血浆袋中，热压封口，置入-20低温冰箱中冻存2周， 制成冷冻异体骨，植入前浸于30-37的0.9氯化钠注射液中复温30分钟。 将另外24块皮质骨做为新鲜异体骨，在2小时内植入受体。,四、动物模型建立LEW大鼠48只做为受体。0.6%戊巴比妥钠（5ml /kg）腹腔注射麻醉，腹卧位固定，左后肢前外侧切口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，沿肌间隙分离，暴露股骨中段，口腔科高速裂钻截骨， 造成股骨干中段3mm4mm大小的骨缺损模型。 将
4、移植骨正位植入后，逐层缝合伤口。,五、主要试剂TGF-1免疫组化试剂盒及TGF-1原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程公司提供）。,六、观察方法取材后组织标本以10%中性福尔马林固定48-72小时；10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5um连续切片，分别进行HE染色，TGF-1免疫组化染色及原位杂交检测。光镜下观察各组移植骨修复情况。,将已判定为阳性的组织切片，随机抽样做空白对照，以PBS缓冲液代替一抗或杂交液。其他步骤不变。以空白对照实验的染色程度确定是否阳性, 空白实验染色强度为阴性,空白对照染色强度为阳性。阳性表达以组织和/或细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为判断标准。以乳
5、腺癌标本作为阳性对照。,七、图像分析和统计学方法1骨组织形态计量分析每张HE染色组织切片随机选取5视野，经计算机自动图像处理系统计算新生骨组织密度。 新生骨组织密度=新生骨组织面积/总骨面积。2TGF-1原位杂交结果图像分析将原位杂交组织切片随机选取 5个视野，经计算机自动图像处理系统提取图中表达阳性信号彩色阈值，计算平均光密度值。,以上数据统计学处理采用SAS软件，进行224析因方差分析。数据以均数标准差表示，P0.05有显著性差异。,结 果,一、组织学观察 主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植： 骨吸收不明显，死骨含量少。 术后1周，移植骨表面、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样组织生成
6、；2周时，移植骨浅表处生成编织骨；4周，板层骨与编织骨掺杂出现； 8周，板层骨排列整齐与移植骨紧密地整合在一起，髓腔再通。 上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-1蛋白及mRNA表达阳性。, 主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植： 移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。 术后第2周，移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现且位置表浅，髓腔内有残余骨小梁。 移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-1蛋白及mRNA表达阳性。, 主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植： 骨吸收活跃，且移植骨周围有
7、大量多核巨细胞浸润。 术后2周， 移植骨边缘及髓腔内有少量新生骨样组织出现；至8周时，新生骨组织很少，移植骨内仍有大片均质状死骨。髓腔无再通迹象。 上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-1蛋白及mRNA表达阳性。, 主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植： 移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。 术后2周，新生骨样组织出现； 4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现，位置表浅，与移植骨整合不紧密，髓腔内有残余骨小梁。 TGF-1蛋白及mRNA表达主要定为于新生骨组织表面的成骨细胞、间充质细胞内。,图1术后2周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（HE 100） 图2术后2周，主要组
8、织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（HE 100） 图3术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（HE 100） 图4术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（HE 100）,图 1 图 2,图 3 图 4,图 5术后1周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（ISH 100） 图 6术后1周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（ISH 100） 图 7术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（ISH 100） 图 8. 术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（ISH 100）,图 7 图 8,图 5 图 6,图 9 图 10,图 11 图 12,2,图
9、9术后4周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（IHC 100） 图 10术后4周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（IHC 100） 图 11术后8周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（IHC 100） 图 12术后8周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（IHC 100）,1随时间延长新生骨组织密度逐渐增高，术后第8周新生骨组织密度最高（P0.05）。2主要组织相容性抗原相配与不配者之间新生骨组织密度有显著性差异（P0.05）。,二、骨组织形态计量分析,3冷冻异体骨移植与新鲜异体骨移植之间新生骨组织密度有显著性差异（P0.05）。4. 主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨
10、移植新生骨组织出现最早，成骨效果最好，术后8周与其他各移植骨相比新生骨组织密度最高（P0.05）。,表2 骨组织形态分析结果,主要组织相容性抗原相配 主要组织相容性抗原不配 时间(周) 新鲜异体骨 冷冻异体骨 新鲜异体骨 冷冻异体骨 1 0.20000.0033 0.13920.0029 0.10700.0032 0.14110.0073 2 0.52360.0188 0.36730.0196 0.15370.0065 0.37010.0020 4 0.61930.0174 0.48150.0135 0.21180.0024 0.43260.0238 8 0.76150.0200 0.7030
11、0.0106 0.30630.0159 0.69890.0096,1 2 4 8,图13 骨组织形态计量分析结果,时间（周）,1供受体间主要组织相容性抗原是否相配影响TGF-1mRNA的表达强度（P0.05）。2移植骨冷冻处理影响TGF-1mRNA的表达强度(P0.05)。3术后时间影响TGF-1mRNA的表达强度（P0.05）。术后8周时TGF-1mRNA表达水平最低。 4时间、移植骨处理以及主要组织相容性抗原是否相配等因素之间存在交互作用（P0.05）。,三、TGF-1mRNA原位杂交检测图像分析,主要组织相容性抗原相配 主要组织相容性抗原不配 时间(周) 新鲜异体骨 冷冻异体骨 新鲜异体
12、骨 冷冻异体骨 1 1.41750.0029 0.99850.0144 0.24090.0075 0.45540.0128 2 0.84700.0085 0.70870.0016 0.25910.0015 1.05440.1224 4 0.61020.0035 0.49940.0017 0.25330.0103 0.48830.0161 8 0.47500.0047 0.41960.0018 0.24380.0061 0.42170.0187,表3 术后不同时间各移植骨TGF-1mRNA表达强度（平均光密度值）,影响因素 F值 P值主要组织相容性抗原(A) 1277.55 0.05移植骨处理(
13、B) 71.19 0.05术后观察时间(T) 449.16 0.05AB 887.30 0.05BT 67.89 0.05AT 393.78 0.05ABT 30.99 0.05,表4 224析因分析结果,1 2 4 8,时间（周）,图14 术后不同时间各移植骨TGF-1表达强度（平均光密度值）,讨 论,一、骨移植修复过程中TGF-1的表达特征目前已经知道，骨损伤修复过程中，TGF-1早期主要源于血小板和局部血液凝固。 血小板脱颗粒释放TGF-1，刺激修复细胞如间充质细胞，成骨细胞增殖、分化，启动修复过程。局部的成骨细胞、破骨细胞可在TGF-1的调节下使骨吸收、骨形成协调进行。,本研究发现，异体骨移植修复过程中，移植骨局部TGF-1的表达水平与成骨效果协同变化，随骨组织逐渐成熟而发生量的变化， 呈现出由高到低的缓慢下降趋势，提示了在移植骨修复过程中，局部内源性TGF -1对骨形成、骨改建起着重要调节作用， 它可以根据损伤修复所需的生物学环境而发生量与分布的变化。,
