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1、,2.2 动物细胞工程,2.2.1 动物细胞培养和核移植技术,2.2 动物细胞工程,单克隆抗体等,动物细胞工程常用的技术,动物细胞培养,动物细胞核移植,动物细胞融合,是其他动物细胞 工程技术的基础。,动物细胞培养技术,动物细胞培养技术,点拨：细胞贴壁,细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易 于帖附。,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,点拨二：接触抑制,有关概念,原代培养：将动物组织消化后的初次培养。 传代培养：贴壁细胞重新用酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。一般
2、传至10代后就不易传下去了。一般来说，细胞在传至10-50代左右时，增殖就会逐渐缓慢，以至于完全停止。,动物细胞培养条件,（2）营养成分：,（3）气体环境,O ：细胞呼吸消耗,CO:调节pH值,（4）温度和pH：哺乳动物细胞培养环境温度控制在36.537.5，Ph7.27.4。,（1）无菌无毒的环境。,相关问题,1.为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官和组织做动物细胞培养材料？,胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛,2.为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,分散成单个细胞便于物质交换，使营养物质吸收及代谢废物排出更容易，利于细胞生长和繁殖,3.为什么用胰蛋白酶处理？,在动物组织间隙中
3、含有一定量的弹性纤维等蛋白质，它们将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官，而弹性纤维易被胰蛋白酶催化分解，从而使细胞分离开。,相关问题,4.培养的细胞为何贴壁生长？,大多数组织细胞不适应悬浮生长，它们必须在固定的表面生长和分裂,5.动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成生物个体？,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,二、动物核移植,1、定义 2、结果：克隆动物 3、生殖方式：无性生殖 4、发展简史（两个阶段） 胚胎细胞核移植：分化程度低，恢复全能性易； 体细胞核移植：分化程度高，恢复全能性难； 5、过程,1996年，英国人Ian Wilmut成功获得体
4、细胞克隆羊“多利”，这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物.,1、取供体细胞并培养 （动物细胞培养技术） 2、采集卵母细胞 （体外培养到M中期） 3、卵母细胞去核 （显微操作去核法） 4、将供体细胞注入去核卵母细胞 5、电刺激使两细胞融合 6、激活受体细胞 （完成分裂和发育，重组胚胎） 7、将胚胎移入受体母牛体内,（1）在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为了使核移植的胚胎或动物的遗传物质绝大部分部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，
5、但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,（2）你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。,二、动物核移植,1、定义 2、结果：克隆动物 3、生殖方式：无性生殖 4、发展简史（两个阶段） 胚胎细胞核移植：分化程度低，恢复全能性易； 体细胞核移植：分化程度高，恢复全能性难； 5、过
6、程 6、应用前景：促进优良畜群繁育；增加濒危动物存活数量； 转基因克隆动物；器官移植等 7、存在的问题,专题2 细胞工程,2.2.2 动物细胞融合,植物体细胞杂交的意义：,打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。,一、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动。,（三） 动物细胞融合,一、发展简史 二、定义 三、方法与过程 四、意义及应用,1970年人鼠细胞融合实验,多核细胞,动物细胞融合的定义,动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,杂交细胞:融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法 化
7、学法,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞 （细胞膜具有一定的流动性）,两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的,为什么灭活的病毒能作为诱导剂？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。,(三)动物细胞融合的意义及应用,1.突破有性杂交方法的局限,打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能。,2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,3.为制造单克隆抗体开辟了新途径。,鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、 人鸡、人蛙、酵
8、母菌鸡 、人胡萝卜等,主要用于制备单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振动、电激） 化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,杂种细胞的筛选,杂种细胞的筛选,四、单克隆抗体,什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,抗原,引起机体产生免疫应答的物质。 如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等。 有多个抗原决定簇。,
9、抗原与抗体特异性结合,体液免疫过程,注意：动物在免疫反应的过程中， 体内产生的特异性抗体种类可多 达百万种以上，但是每一个B淋巴 细胞只识别一种特异性抗原决定 簇，因此每一个B淋巴细胞只分 泌一种特异性抗体。,（一）获得抗体的传统方法,1、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。,2、缺点：产量低，纯度低，特异性差。,人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。,1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念,用单个B淋巴细胞进行
10、克隆，得到的细胞群能够分泌针对某一种抗原决定簇的抗体，这种单一的抗体就叫做单克隆抗体。,2、怎样才能获得单克隆抗体？,提示1：仅用细胞培养技术可行吗？,提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？,传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去了。一般来说，细胞在传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止。,传代培养过程中，部分细胞的细胞核型可能会发生变化。当继续传代时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。,单克隆抗体的制备过程,1.注射特定
11、的抗原，获得免疫小鼠,2.获取相应的B淋巴细胞并培养,3.获取骨髓瘤细胞并培养,4.将两种细胞进行动物细胞融合,5.用特定的选择性培养基筛选杂交瘤细胞（第一次筛选）,6.克隆杂交细胞（动物细胞培养）,杂交细胞只有一种吗？,7.将不同杂交细胞分开，筛选产生专一抗体的杂交瘤细胞（第二次筛选）,8.单克隆抗体的大量制备（体外培养杂交瘤细胞或注射到小鼠腹腔内增殖），从细胞培养液或小鼠腹水中获取。,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。,HAT选择性培养基,筛选杂交瘤细胞,只存活5-7天,
12、96孔板,加样枪,将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。,专一抗体检测方法,出现红色即为专一抗体检验阳性的杂交瘤细胞培养上清液,阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞，所产生抗体为单克隆抗体。,整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞,第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定
13、抗体的细胞群,单克隆抗体,（三）单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体特异性强，灵敏度高，并可大量制备。,应用主要有：,1、作为诊断试剂（抗原-抗体特异性结合）,准确地识别各种抗原物质的细微差异优点：准确、高效、简易、快速,单克隆抗体作为诊断试剂,流感病毒：“H N ”是病毒名称的缩写，其“H”指的是血球凝集素、而“N”指的是神经氨酸酶，两种都是病毒上的抗原名称。血球凝集素共有116型，神经氨酸酶共有19型。H1N1，H5N1，H7N2，H1N7，H7N3，H13N6，H5N9，H11N6，H3N8，H9N2，H5N2，H4N8，H10N7，H2N2，H8N4，H14N5，H6N5，H12N5，H7N9，H10N8等等。,人绒毛膜促性腺激素（HCG）是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素。早早孕检测试纸应用免疫层析双抗体夹心法，制成HCG检测试纸，可在3分钟内测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗HCG-亚基单克隆抗体时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。,血型检测,用于治疗疾病和运载药物,把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，制成“生物导弹”。,作为药物,（三）单克隆抗体的应用,
