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1、第五章 细菌检验技术,学习目标： 掌握：革兰染色的原理、操作及结果判断；细菌接种技 术、培养方法、细菌在不同培养基中的生长现象、生化反应的原理。 熟悉：细菌染色标本检查的基本程序，细菌培养常用培养基和器材。 了解：细菌不染色标本的检查方法和用途；免疫学技术、分子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。 本章重点：革兰染色的原理、操作方法及意义细菌培养及生长现象细菌生化反应及临床应用,第一节 细菌形态检验技术,一、染色标本镜检 （一）染色标本检查的一般程序,1. 单染色法 细菌标本经涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分钟，水洗后待玻片燥后即可镜检,（二）常用的染色方法,（二）常用的染色方法2. 革
2、兰染色法【方法】,（二）常用的染色方法2. 革兰染色法【结果】,紫色革兰阳性菌（1000）,红色革兰阴性菌（1000）,（二）常用的染色方法3. 抗酸染色法【结果】,抗酸染色结果（1000）：红色为抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌,（三）其他染色法1. 特殊结构染色法 （1）荚膜染色法,（三）其他染色法1. 特殊结构染色法 （2）鞭毛染色法,（三）其他染色法1. 特殊结构染色法 （3）芽孢染色法,（三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （4）异染颗粒染色法,Albert染色,奈瑟染色,（三）其他染色法1. 负染色法,墨汁荚膜染色（脑脊液中的新型隐球菌，400）,第一节 细菌形态检验技术,二、不染色标
3、本镜检 1. 压滴法,压滴法镜 检结果： 尿涂片，400,二、不染色标本镜检 2. 悬滴法,三、其他显微镜检查,第二节 细菌接种与培养技术,红外接种灭菌器,一、基本条件,培 养 箱,生物安全柜,一、基本条件,培养基成份,培养基：人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。 营养物质：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇类、血液、鸡蛋及动物血清、生长因子、无机盐等 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂：孔雀绿、煌绿、胆盐、抗生素等 指示剂：溴麝香草酚蓝，溴甲酚紫、酚红等,基础培养基：普通琼脂平板 营养培养基：满足营养需求较高细菌的生长，如血琼脂平板、巧克力琼脂平板等 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌
4、，如克氏双糖铁培养基（KIA）及各种生化反应用培养基 选择培养基：具有选择性抑制非目的菌生长作用，用于选择性培养目的菌，如SS平板、中国蓝琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板等 增菌培养基：用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤、GN增菌肉汤 特殊培养基：厌氧培养基、L型细菌培养基,培养基种类（按用途分）,培养基,液体培养基,培养基的种类（按物理性状分类）,液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.20.5琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含23琼脂，用于细菌的分离培养。,培养基灭菌, 基础培养基：121高压蒸汽灭菌15分钟, 含糖培养基：113 灭菌15分钟, 含鸡蛋、血
5、清培养基：间歇灭菌3天3次, 不耐高温的液体成分：滤过除菌,调配溶化调Ph过滤澄清分装灭菌检定保存,培养基制备程序,培养基制备程序,（一）无菌技术,细菌检验的操作应在无菌室或生物安全柜内进行 无菌室、生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌 细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理 标本的采集严格无菌操作 无菌试管、烧瓶的使用时注意管口灭菌,二、细菌接种与培养技术,（二）细菌接种与分离技术,灭菌接种环（针）冷却挑取标本（细菌）接种灭菌接种环（针）,平板划线法,分区划线,连续划线,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,连续划线法,斜面接种,半固体穿刺接种
6、,液体接种,（三）细菌培养方法,一般培养（需氧培养）：培养需氧或兼性厌氧菌 培养温度：35 37 培养时间：1824小时二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等培养厌氧菌,三、细菌的生长现象,菌落与菌苔,血平板上溶血现象,细菌在液体培养基中生长现象,沿穿剌线扩散生长,在穿剌线上生长,细菌在半固体培养基中的现象,一、碳水化合物的代谢试验,第三节 细菌生化鉴定技术,原理：多糖单糖丙酮酸酸性产物(或产气) pH 呈酸性变色(或出现气泡)方法： 将待检细菌以无菌操作接种到糖发酵管中，置35温箱培养1824h，观察结果。,1、糖（醇、苷）类
7、发酵试验,结 果,一、碳水化合物的代谢试验,原理：根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧分子需求的不同，将细菌分为氧化、发酵和产碱型三类,2、 O/F试验,方法：取2支HL葡萄糖培养管煮沸驱氧，冷却后接种细菌。将其中一管敞开，另一管用液体石蜡封管，培养18 24h观察结果,3、甲基红试验,原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，进一步分解生成大量混合酸，使培养pH下降至4.4以下，加入甲基红后，呈现红色反应。为甲基红试验阳性。,方法：将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水中,35培养1824小时后,往培养基中加入甲基红指示剂少许,观察结果。,主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌,4、V-P试验,原理：细菌分解葡
8、萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中，乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与胍基化合物结合，生成红色化合物，是为V-P试验阳性。,方法：把待检细菌接种在葡萄糖蛋白胨水中，35培养1824h后，按每毫升培养液加入0.1ml含2肌酸或肌酐的40KOH溶液,数分钟或数小时后观察结果。,结 果,空白对照 阴性 阳性,5、 -半乳糖苷酶试验（ONPG）,原理：有的细菌可产生-半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚-D半乳糖苷(ONPG)而生成黄色的邻硝基苯酚，该试验也称为ONPG试验。,方法：将被检制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，37水浴5 分钟，使酶释放，然后再加入0.25ml ONPG，混匀
9、后，置于37水浴中温育，菌悬液呈黄色为阳性反应。,阴性 阳性,6、七叶苷水解试验,原理：某些细菌能分解七叶苷产生葡萄糖与七叶素，七叶素与培养基中的Fe2+结合后，形成黑色的化合物，使培养基变黑。,方法：将待检细菌接种到七叶苷培养基上，培养后观察结果，培养基变黑色者为阳性，培养基不变色为阴性。,+,-,二、蛋白质和氨基酸的代谢,原理：细菌产生色氨酸酶，分解培养基中色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质， 是为靛基质试验阳性。,方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，35培养1824h，取出后沿试管壁加入靛基质试剂数滴，在两液面观察结果。,结 果,1、靛基质（吲哚）试验
10、,二、蛋白质和氨基酸的代谢,原理：细菌产生酶，分解含硫氨基酸生成硫化氢，硫化氢与培养基中的亚铁盐或铅盐结合生成黑色化合物。,方法：将细菌穿刺接种到醋酸铅培养基中， 35、1824h，观察结果。,结果：黑色管为阳性,2、硫化氢试验,原理：细菌产生脲酶，水解尿素生成氨和二氧化碳，培养基呈碱性反应,方法：将待检菌接种于尿素培养基中，35培养1824h取出观察。,3、尿素酶试验,- +,原理：细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与三氯化铁作用，形成绿色化合物,方法：将待检菌接种于苯丙氨酸微量培养管中（接种量稍大），培养后在培养基上直接滴加10氯化铁试剂，出现绿色反应者为阳性。,
11、4、苯丙氨酸脱氨酶试验,- +,三、碳源利用试验,原理：有的细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，细菌在生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐，使培养基呈碱性反应,方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，培养后观察结果。培养基由淡绿色变为深蓝色者为阳性，培养基中无菌生长、仍为绿色者为阴性。,1. 枸橼酸盐利用试验,+ -,四、酶类试验,原理：某些细菌具有氧化酶（细胞色素氧化酶），能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺氧化生成红色的醌类化合物。,方法：取洁净滤纸条，粘取被检细菌菌落，滴加氧化酶试剂1滴于菌落上。或将试剂直接滴加在被检细菌的菌落上。阳性者立即出现红色，继而变为深红色至深紫色。,1、氧化酶
12、（细胞色素氧化酶）试验,原理：细菌产生的触酶（过氧化氢酶）能催化过氧化氢放出初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。,方法： 取待检细菌少许，置于洁净的载玻片上，滴加3H2O2试剂12滴，观察结果。一分钟内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。,2、触酶试验,原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。,方法：于3支试管中分别加入1:4稀释的血浆0.5ml，1支管加入待检菌肉汤培养物0.5ml,另两支分别加阴阳性对照菌肉汤培养物0.5ml，35培养34h后观察结果。,3、凝固酶试验（试管法）,原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤
13、维蛋白。,方法：取未稀释的兔血浆和生理盐水各一滴分别置于载玻片的两侧，挑取金黄色葡萄球菌少许分别与它们混合，立即观察结果。细菌在生理盐水中无自凝，菌液呈均匀混浊状态凝固酶试验为阴性；菌液聚集成团块或颗粒状，则血浆凝固酶试验为阳性。,4、凝固酶试验（玻片法）,第三节 细菌生化鉴定技术,原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮磺酸，再与-萘胺结合，生成N-萘胺偶氮苯磺酸(红色化合物)。,方法：将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，35培养1824小时，加入甲液（对氨基苯磺酸0.8g、5molL醋酸100ml）和乙液（-萘胺0
14、.5g、5molL、醋酸100ml）等量混合液，观察结果。立即出现红色者为阳性。若加入试剂不出现红色，需要检查硝酸盐是否被还原，可于培养管内加入少许锌粉，如无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐还原试验为阳性。若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检细菌无还原硝酸盐的能力，硝酸盐还原试验为阴性。,5、硝酸盐还原试验,红色为阳性 无色为阴性,5、硝酸盐还原试验,-,+,无色+锌粉无色：阳性 无色+锌粉红色：阴性,+,-,原理： B群链球菌能产生CAMP因子，可促进金黄色葡萄球菌溶血素活性。其他链球菌不产生CAMP因子。,方法：用产生-溶血素的金黄色葡萄球菌在血平板上划种一条直线，将
15、待检菌距金黄色葡萄球菌3mm处垂直划种一短线。用同样方法接种阴性和阳性对照菌株。35孵育1824,结 果,6、CAMP试验,对照,阴性,阳性,检测菌,阳性,阳性,矢状溶血,五、复合生化反应,原理：KIA琼脂中含有牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸橼酸铵铁、酚红指示剂等。乳糖的浓度为葡萄糖的10倍，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，培养基中的葡萄糖被分解后只能产生少量的酸，在最初培养的811小时内，这些酸也足以使培养基的底层和斜面变黄色。但连续培养数小时后，在细菌和氧的作用下，培养基的斜面所含氨基酸发生降解，释放氨类，立即中和斜面部分的酸，培养1824小时后，整个斜面转变成碱性，斜面又变成
16、红色。培养基深层中，氨基酸的降解作用不足以中和所形成的酸，故仍呈黄色。因此KIA斜面呈碱性，深层呈酸性反应，说明该菌只分解葡萄糖而不分解乳糖。若细菌分解乳糖则产生大量的酸，这些酸能中和斜面产生的碱，使整个培养基呈黄色。若细菌能分解培养基中含硫氨基酸，则可产生H2S，H2S与培养基中枸橼酸铵铁起反应，产生不溶性的黑色硫化亚铁沉淀。,KIA试验,六、复合生化反应,方法： 用接种针挑取待检细菌，先穿刺接种到KIA深层，距管底35mm为宜，再从深层向上提起，在斜面上由下至上划线，35培养1824小时，观察结果,KIA试验,常见的反应结果：斜面碱性/底层碱性：不发酵糖类，如粪产碱杆菌。斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如志贺菌。斜面碱性/底层酸性（黑色）：葡萄糖发酵、乳糖不发酵，产生H2S。如沙门菌、普通变形杆菌。斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖发酵，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属。,
