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1、,Company Logo,白念珠菌支气管肺感染对大鼠肺TLR2表达和IL-10水平的影响,硕士研究生：林莉导 师：王莉,,Company Logo,Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）是新近发现的同源于果蝇Toll的蛋白分子，属于型跨膜蛋白受体，TLRs能对病原体识别、结合、引发一系列信号间的传导，促进各种炎症介质的释放。,立题依据:,Toll样受体,,Company Logo,立题依据：,TLR2识别暴露细胞壁表面的成分甘露聚糖等病原体相关分子模式后，可通过跨膜结构将白念珠菌壁上的甘露聚糖等分子的刺激信号转导入细胞内，通过胞内段Toll/IL-1R(TIR)以
2、髓样分化因子88(MyD88)依赖和非依赖途径分别激活NF-B和丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）级联反应通路激活天然免疫系统，引发前炎症因子的释放，介导急性期反应，直接杀伤病原微生物。引发获得性免疫反应的激活。,,Company Logo,,Company Logo,大量体外研究认为念珠菌感染后能使免疫细胞表面表达的TLR2水平上升。研究也证实LPS能使大鼠体内TLR2表达水平增高。但白念珠菌感染后大鼠体内肺TLR2表达的情况还鲜有报道。,立题依据：,,Company Logo,立题依据：,白念珠菌支气管肺感染大鼠肺TLR2和 T
3、h2细胞因子IL-10的表达和变化情况也存在争议。,,Company Logo,立题依据：,而Roger等发现在感染的早期虽然Treg细胞的数量增多而功能却受到抑制，导致效应T细胞的大量激活，通过呼吸爆发等作用大量杀灭病原体，而在后期当白念珠菌的水平下降到一定水平后Treg的活性恢复，避免过度炎症损害机体。,,Company Logo,通过研究肺部白念珠菌感染后不同时间（3天、7天）肺组织TLR2的表达，Th2分泌细胞因子（IL-10）的水平，及感染程度。探讨白念珠菌感染对TLR2的表达水平和肺组织匀浆上清液中IL-10水平的影响，以及它们在肺部白念珠菌感染中的发病机制中的作用。,研究目标：,
4、,Company Logo,1.肺部白念珠菌的感染情况（PAS法） 2.观察感染后不同时间大鼠肺组织炎症变化 （HE染色 ） 3.肺部白念珠菌感染后3天、7天大鼠肺组织中TLR2的表达（免疫组化法） 4.肺组织匀浆上清液IL-10水平（ELISA法),研究内容：,,Company Logo,技术路线：,3天组,7天组,3天组,7天组,3天组,7天组,3天杀鼠,免疫功能低下对照组,生理盐水对照组,感染组,7天杀鼠,取肺组织,固定，包埋，制成切片,固定，包埋，制成切片,冻存，匀浆，离心,HE染色,PAS染色,免疫组化,ELISA,统计分析,得出结论,,Company Logo,免疫功能低下动物模型
5、建立【1，2】：,实验动物常规饲养两周后，第1，3，5，7，9，11，13天给予免疫低下组和感染组大鼠皮下注射醋酸氢化可的松，每次80 mg/kg,成功建立免疫功能低下模型；正常组于相同时间给予同等剂量的生理盐水皮下注射。【1】 马壮 钱桂生 黄桂君，等。免疫功能低下Wistar大鼠白念珠菌肺炎模型的建立 J . 中华微生物学和免疫学杂志，2001，21（5）：569-573. 【2】 Lewis RE ， Lund BC ， Klepser ME ， et al. Assessment of antifungal activities of fluconazole and amphoteri
6、cin B administered alone and incombination against Candida albicans by using a dynamic in vitro mycotic infection model J .Antimicrobial Agents and Chemotherapy ， 1998 ， 42 （ 6 ）： 1382-1386,关键步骤：,,Company Logo,感染动物模型的建立 【1，2】,动物免疫功能低下建立后的第14天，用4%水合氯醛（0.3 ml/100g）腹腔注射麻醉动物，麻醉成功后，感染组经气管插管注射白色念珠菌混悬液0.2m
7、l /只，正常组及免疫功能低下组经气管插管注射同等剂量的生理盐水。【1】 马壮 钱桂生 黄桂君，等。免疫功能低下Wistar大鼠白念珠菌肺炎模型的建立 J . 中华微生物学和免疫学杂志，2001，21（5）：569-573 【2】 Lewis RE ， Lund BC ， Klepser ME ， et al. Assessment of antifungal activities of fluconazole and amphotericin B administered alone and incombination against Candida albicans by using a
8、dynamic in vitro mycotic infection model J .Antimicrobial Agents and Chemotherapy ， 1998 ， 42 （ 6 ）： 1382-1386.,关键步骤：,,Company Logo,连接白念珠菌感染后天然免疫细胞的TLR2受体表达与获得性免疫因子（IL-10）之间的相互关系。 体内研究白念珠菌肺感染后TLR2的表达。,创新之处：,,Company Logo,1.PAS染色白念珠菌浸润情况,结果：,,Company Logo,2.白念珠菌感染肺组织大体情况,感染后第3天 感染后第7天,结果：,,Company Lo
9、go,3.HE染色白念珠菌感染情况,结果：,正常组第3天,正常组第7天,,Company Logo,免疫功能低下组第3天,免疫功能低下组第7天,结果：,,Company Logo,感染组第3天 感染组第7天,结果：,,Company Logo,结果：,4.免疫组化TLR2的表达情况,正常组第3天 正常组第7天,,Company Logo,免疫功能低下组第3天 免疫功能低下组第 7天,结果：,,Company Logo,感染组第3天 感染组第7天,结果：,,Company Logo,表1.各组TLR2表达的IOD值（104）,组别 正常组 免疫功能低下组 感染组,3天组 2.390.16 2.3
10、00.35 3.840.47P值 p0.05 # p0.05 # p0.05 ；*相同时间感染组与免疫功能低下组比较p0.05；#感染组内比较 p0.05；,,Company Logo,各组大鼠肺部TLR2的表达,,Company Logo,表2.各组肺组织匀浆上清液IL-10的表达（pg/dl）,组别 正常组 免疫功能低下组 感染组,3天组 52.211.72 64.715.13 85.688.01p值 p0.05# p0.05*7天组 51.931.90 82.083.51 * 119.436.84#P值 p0.05# p0.05 ；*相同时间感染组与免疫功能低下组比较p0.05； *免疫
11、功能低下组内比较p0.05；#感染组内比较p免疫功能低下组生理盐水对照组。,结论：,一.组间比较,,Company Logo,1.TLR2： （1）生理盐水对照组，3天和7天比较没有明显的差异。 （2）免疫功能低下对照组，3天和7天比较没有明显的差异。 （3）感染组，7天3天。 2.IL-10： （1）生理盐水对照组，3天和7天比较没有明显的差异。 （2）免疫功能低下对照组，7天3天。 （3）感染组，7天3天。,结论：,二.组内比较,,Company Logo,1. 念珠菌感染后第3天和第7天肺组织TLR2的表达和肺组织IL-10 并未发现明显的相关性。2.感染组3天和7天IL-10的水平和免
12、疫功能低下3.3天和7天并未发现明显的相关性。,结论：,三.两指标之间的相关性,,Company Logo,讨论：,针对感染不同时间TLR2表达并没有变化，推测其原因我们认为可能存在以下因素：首先， 从我们的结果说明早期（3天）和后期（7天）TLR2是表达在同一水平的，那么是否TLR2在感染的过程中始终保持不变，还是曲线变化在这两个时间点在同一水平还需进一步的验证。其次，我们采取的是半定量的免疫组化的手段，来测量TLR2的表达情况，结果不够稳定。再次，由于我们的实验对象有限，只是做小样本的估计，对总体的代表性不佳，而且，我们做的是体内实验，进一步的细胞水平的实验更能直观的表现。,,Company Logo,
