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1、1,Chapter 9 基因操作 （中国医科大学医学遗传学教研室 ）,第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、基因文库 第三节、分子杂交及相关技术 第四节、DNA多态,2,第九章 重点内容提示,基因操作，重组DNA技术,原理,步骤 限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平末端，粘末端） 基因载体（vector）,条件，常用载体 基因探针，来源 克隆(clone) 探针标记方法:nick translation (缺口平移)、随机引物法 DNA多态，RFLP ，VNTR，STR ，微卫星DNA PCR 方法、原理、应用 Southern Blot:方法、原理、应用 Northern-Blot：方
2、法、原理、应用,3,Chapter 9 基因操作,70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。,4,1946 1950 1955 1960 1965,1970 1975 1980 1985 1990 1995,1944DNA是遗传物质,1949Hbs贫血,1953双螺旋,1956HbsGlu-Val,1966遗传密码,第一个R酶,1972重组质粒,1975DNA杂交,1977DNA测序,1981转G小鼠,1983HD病G定位,1985
3、PCR,1986位置克隆,1987G剔除小鼠,1989位置克隆,1990第一个基因治疗,1995细菌G组序列,1996酵母基因组序列,现代分子遗传学发展 重要事件,5,第一节 重组DNA技术-基因工程,重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。,6,一、限制酶,限制性
4、内切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶。（“分子手术刀”） 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。,7,1、限制酶的命名,根据其来源命名。如：属名 菌株名E co R I种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。,8,2、限制酶识别序列和切割形式,每种限制酶能识别和切割的通常48个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）或切点。如：Hare III 5
5、-GGCC- 33-CCGG- 5Bam HI 5-GGATCC-33-CCTAGG- 5平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形式粘性末端（sticky end）交错切,9,10,5 C T G C A G 3 3 G A C G T C 5,5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5,5 G A T C 3 3 C T A G 5,5 G G C C 3 3 C C G G 5,Hae,Mbo,BamH,Pst,限制性内切核酸酶,11,互补末端连接,12,13,产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式：,1)用同一种限制酶切割； 2)用识别相同靶
6、序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。,14,3、特点：,根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途： 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。,15,二、基因运载体及其选择,载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。,16,载体具以下特征：1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞
7、并在其中增殖；2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。常用的载体：质粒，噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。,17,（一）质粒 plasmid,Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。PBR322大肠杆菌 pSC101Plasmid chromosome COIEIplasmid 革兰氏阴性菌 pc194scp12真核生物-酵母质粒,18,常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因
8、插入到MCS后，-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,APR,pUC19,19,（二）.-噬菌体(phage),是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。可包装3752kb DNA分子. 改建后的噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：,20,置换载体 溶解途径载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA
9、。插入载体 裂解途径DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。,21,裂解途径,22,（三）.粘粒(cosmid vector)（3050kb）,是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装3050 kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。,23,(四) 大片段DNA克隆载体,人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基
10、因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。,24,1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb。在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。,25,2、噬菌体PI载体和PAC,PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110115kb
11、）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。 1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-PAC。,26,3、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC）,适用于克隆大片段DNA，0.22Mb。,27,28,YAC 的主要功能成份有三：,着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,29,
12、三、DNA重组与分子克隆化,为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。,30,基本原理与过程：,1、构建重组DNA：分离纯化目的基因目的基因 + vector =重组DNA分子 2、转化：重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。3、细胞克隆的筛选: 筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone），将转化的细胞至于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 4、分离重组DNA克隆：
13、即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。,31,分离纯化目的基因 目的基因 + vector =重组DNA分子,32,restriction endonuclease,重组DNA技术流程简图,33,ligase,重组DNA技术流程简图,vector,restriction endonuclease,34,重组DNA和 分子 克隆,35,重组DNA和分子克隆的几种方法：,1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆； 2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 3、化学合成目的基因进行克隆 4、PCR体外扩增目的片段进行克隆,36,筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone）,
14、37,筛查含有目的基因的细胞克隆,38,从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,39,40,四、目的基因表达,上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。 重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物RNA，蛋白质。 就是将目的基因与表达载体重组(含激动子)，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆（expression cloning）.,41,目 的 基 因 表 达,42,（一）真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达,原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），
15、因此不能直接表达。 通常采用大肠杆菌为宿主。真核多肽的表达要求：1）适当的cDNA（完整的编码序列）；2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 产物特征：1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；2）活性受限或无活性。,43,(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达,真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。 应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。 产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。,44,第二节、基因文库,基因文库（gene library）应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的克隆。,45,一、 构建 基因 组 DNA 文库,46,Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage vector,47,二、染色体特异的基因文库 （ chromosome specific library）,单个染色体: 细胞克隆 （流式C仪） 细胞 染色体 染色体文库染色体区带: 区带特异 （显微切割 ） DNA文库,
