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1、食品中大肠菌群的检验,1. 食品微生物检验的意义,有害微生物对人类和生产的影响： 引起食品变质 引起食物中毒 导致人体患病,1. 食品微生物检验的意义,是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定被检食品能否食用的科学依据 可以判断食品加工环境及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据 可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生 保证产品的质量,避免不必要的损失,生产环境的检验,原辅料的检验,食品加工、储藏、销售 储环节的检验,食品的检验,2. 食品微生物检验的范围,3. 食品卫生标准中的微生物指标,指示菌 概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物 类型：一般性、
2、特定性（如粪便污染）、其他 项目：菌落总数 、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群,一、实验目的,1. 了解大肠菌群在食品检验中的意义。 2. 掌握检验的程序和步骤。 3. 通过MPN检索表的检索得出实验结果。,二、基本原理,大肠菌群系指一群在3237下24h内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。具有广泛的卫生学意义。,产气克雷白氏菌,大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染 。,
3、大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。,总大肠菌群系指一群在37培养24小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。,致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞
4、，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。,O157:H7（EHEC) 肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。,大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系,大肠菌群的食品卫生学意义,作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低 作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系 要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量,GB 4789
5、.3-2010 大肠菌群计数第一法：大肠菌群MPN计数法 第二法：大肠菌群平板计数法,三、检测方法,最近似数测定法（MPN）是指对未知样品做连续的10倍稀释，选择3个连续的10倍稀释液，每种稀释液接种3管装有培养基的试管中培养，根据LST初发酵试验以及BGLB发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数。食品中大肠菌群数以每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数来表示，即为大肠菌群MPN值。,需要用到的培养基,（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨 成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL 5.0g，乳糖5.0g，K2HP
6、O4 2.75g，KH2PO4 2.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。 制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm150mm试管中，每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH6.80.2。,（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤 成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.20.1。 3个三角瓶（含玻珠）中，225ml/个 9支试管，3支/组，9ml/支,抑菌剂的选择,大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。 抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别
7、是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。,实验步骤及操作要点：,1）无菌取样并制作梯度稀释液；梯度稀释法依次稀释样品到10-42）样品匀液的pH 值应在6.57.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。 3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。,10-2,10-3,10-4,0,将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤,LST不产气（-） 小导管里无气泡
8、,LST产气（+）,4）初发酵试验选择10-2、10-3、10-4三个稀释度的样品均液 （液体样品可以选择原液）， 用无菌移液管分别吸取1mL到LST发酵液试管中，每管接种1mL， 每个稀释度做3个平行（共9管）,361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。,LST结果判断,大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。,5）复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。,表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表,思考题,1大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何作用？ 2在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存在极微小的气泡，这种情况可否算作产气阳性？ 3造成本实验误差的主要原因有哪些？,
