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1、表1-6 不同表型分群方法比较,2.2 特殊基因扩增片段酶切图谱分析,特殊基因扩增片段酶切图谱分析是指用PCR技术将特定的DNA片段扩增出来，然后对扩增产物进行限制性酶切，电泳分离酶切后的DNA片段，这样得到的电泳图谱条带较少，可以进行直接比较。该方法就是大家所熟悉的限制性酶切片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),在细菌分类中，用于RFLP分析的基因主要是rrn操纵元，即23S rDNA, 16S rDNA及两基因之间的插入片段ITS,以Rhizobia 16S rDNA PCR-RFLP为例,方 法,细胞悬浮液：细菌在
2、TY斜面 28培养24 h用无菌蒸馏水洗涤离心收集,DNA模板的制备,水煮细胞上清液： 细胞液在 水浴中煮10 后取上清液 A620=0.15 苯酚氯仿提取总DNA GUTC方法,模板DNA： 纯DNA 50ug细胞悬浮液 510ul 水煮细胞上清液 10ul 反应缓冲液: 10mM Tris-Cl pH 9.050mM KCl1% Triton-X5001.5mM MgCl2,反应液的配制,dNTP（脱氧核苷酸混合物）20uM Primer: fD 20nt 0.1uMrD 17nt 0.1uM Taq DNA聚合酶 2.5u 无离子水补至 100ul 在上面覆盖适量的石蜡油,初始变性：95
3、 35min 扩增循环：35变性 94 1min退火 55 1min延伸 72 2min 最终循环：延伸72 3min, PCR扩增条件,11.2琼脂糖3ul 扩增产物1500bp, 扩增产物的检测,反应液：PCR产物 815ul酶不少于5U (Hinf 等)ddH2O、缓冲液酶 切：3h以上电 泳：3-4琼脂糖、80- 100v、 3h、胶长1114cm, 酶切、检测及分析,染色：0.5 ug/ml溴化乙锭（EB）照相或扫描分析：Gel Compar ,PCR仪,EB区,EB区,凝胶成像仪,结果,部分菌株16S rDNA的MspI酶切电泳图谱,部分菌株16S rDNA的HinfI酶切电泳图谱
4、,图4 部分菌株16S rDNA的AluI酶切电泳图谱,图5 部分菌株16S rDNA的HaeIII酶切电泳图谱,8,Mesorhizobium,Sinorhizbium,Agrobacterium-Rhizobium,Bradyrhizbium,图6 16S rDNA PCR RFLP 聚类结果图,5 M. plurifarium,6 Mesorhizobium,18 A. tumefaciens,19 Agrobacterium,20 B. japonicum,23 B. elkanii,Phena,4,5,3,1,2,6,6, 7,10 Rhizobium sp.,16 Rhizobiu
5、m sp.,22 B. yuanmingense,5 优 点（16S rDNA PCR-RFLP）,初步确定细菌系统发育地位快速鉴别种及种以上水平的遗 传关系；重复性、稳定性好，方法成熟、易于掌握；可同时对大量菌株进行初步分群,23S rDNA含有的遗传信息多，但应用不如16S rNDA广泛。,16-23S rDNA-IGS变异程度比较大，灵敏度高，因而可用于对细菌不同生物型、菌株、种、属的分类鉴定，甚至可用于区分关系非常近的种,ARDRA: rDNA PCR-RFLP分析 （Amplified Ribosomal DNA- Restriction Analysis）,2.3 保守基因序列分析
6、与系统发育分析,系统发育是现代细菌分类、鉴定和命名的基础,由于16S rRNA存在于所有的原核生物中；功能保守、进化缓慢；变化速度可覆盖整个进化历史且序列变化的速度与进化相当；分子大小适中，能够提供足够的遗传信息，又适于研究操作，因此，16S rNDA序列的测定，已经成为细菌遗传多样性和分类研究中不可缺少的内容,16S rRNA序列同源性是确定属的关键指标，16S rRNA同源性低于97%为不同的种，然而依据16S rRNA序列定种没有界限，很难区分亲源关系比较近的种,谷氨酰胺合成酶基因（GS 和GS ）、柠檬酸合成酶基因（gltA)、atpD、recA、DnaK等基因也被用于细菌的系统发育分
7、析,nod和nif基因也被用于揭示根瘤菌的遗传多样性,多序列位点分型（Multilocus Sequence Typing, MLST),在MLEE分析技术上发展起来的，利用测序技术对细菌染色体上不同位点的保守基因序列进行比较分析，以确定各种细菌的亲源关系和分类地位,目前主要用于对病原微生物的分子分型、群体遗传和进化生物学研究,MLST的优点：,分辨率高，可以分辨出各基因的所有变异，避免了MLEE中的不确定因素 核苷酸序列提交到特定的网站，通过互联网可以实现资源共享 可以研究各物种的群体遗传和生物进化 为微生物分类学家寻找16S rDNA以外的分子作为系统发育“进化钟”提供了依据,目前这些保守
8、的基因序列主要包括：atpD，recA，dnaX，glyA，recN，atpA，rpoA 等（Zeigler 2003）。由于这些保守基因位于染色体的不同位置，根据这些基因序列也许可以预测不同细菌的基因组组成的相关性，进而可以代替细菌分类中重要的、操作复杂的DNA 同源性分析技术,不同基因序列相似性达到多少可以反映其相应DNA同源性的水平，仍需要通过大量的序列信息进行比较研究，进而利用数学统计方法建立起两者之间良好的相关性，才能够进一步更广泛的应用到细菌分类研究中,一DNA碱基组成分析二. DNA-DNA杂交,2.4 基因组DNA同源性分析,DNA-DNA同源性分析及G+C mol%的测定已成
9、为细菌分类鉴定中的基本方法，并已成为描述细菌分类单元的一个标准。国际系统细菌学委员会规定，DNA同源性70%、热解链温度差Tm5为细菌种的界限(Wayne et al. 1987)。由于这一界限过于严格，Ursing等(1995)认为DNA同源性在5070以上、Tm在57以下为种群的界限。一般来说细菌种内菌株之间的DNA G+C mol%差别不大于3，属内差别不大于10（Stackebrandt & Liesack 1993）。,一、 DNA G+C mol%测定,每种生物都有特定的DNA G+C mol%含量，细菌的DNA G+C mol%含量变化较大，可达到2580。不同细菌类群，其G+C
10、 mol%也不同。,同种的细菌G+C mol%含量变化较小，比较稳定， 不受菌龄、生长条件等外界因素的影响。,G+C mol%是细菌分类与鉴定的一个重要指标。,G+C mol%含量的作用主要在于“否定”一般认为 同种内不同菌株的DNA G+C mol%的差异不大于4-5%， 同属不同种的差异不大于10%。如果两个菌株的DNA G+C mol%差异大于5%，就可以判断这两株菌不属于同一个种。这时，DNA G+C mol%这项实验的判断价值要比形态和生理生化实验的价值都大，甚至在其它性状相似的情况下，也可以做出这样的判断。,当天然双链DNA分子在一定的离子强度和pH条件下逐步加热使温度升高到一定值
11、时，碱基之间氢键不断打开，互补的DNA双螺旋不断变成单链，导致在260nm的紫外吸收明显增加(即增色效应)；当双链DNA完全变成单链后，紫外吸收值停止增加。,实验原理,在热变性过程中，双链DNA解开一半时所对应的温度值，为热解链中点温度(Tm值)。,Tm值随G+C mol%的增加而增加，因为在GC碱基对中含3个氢键，在A=T碱基对中含有2个氢键；破坏GC对比破坏A=T对需要更高的温度。这样，Tm值可反映不同细菌的DNA G+C mol%含量。,G+C含量每增加1，Tm值随之增加0.4,Tm值测定最主要的影响因素是溶液的离子强度。单价阳离子浓度每增加10倍， Tm增加16.6。,DNA分子量对T
12、m值基本无影响。,Tm值测定的影响因素:,（一）实验菌株及其培养实验菌株(Agrobacterium sp., Rhizobium sp.)， YMA斜面活化后，接种于TY培养液中, 28振荡培养,至对数中后期，确定无杂菌污染。,实验材料及步骤,菌体收集将培养至对数中后期的菌体，5600rpm，15min，4离心收集。用1TES悬浮菌体，同样条件下离心、洗涤3次。,1、 DNA 提取所需试剂 1TES,10SSC,2SSC, 0.1SSC, 3M NaAc-1mM EDTA-Na2，pH7.0 20% SDS(w/v), 70%乙醇, 95%乙醇,5M NaClO4 P：C：I(苯酚：氯仿：异
13、戊醇)=25：24：1(v/v) C：I (氯仿：异戊醇)=24：1(v/v) 蛋白酶K：以20mg/ml的浓度溶于水中，37 保温自消化1小时，-20保存备用 溶菌酶:10mg/ml,置-20保存 RNase：10mg/mL,置-20保存,（二）菌株DNA的提取,2、 DNA提取步骤 1-1.5g菌体，加入TES (10ml)，充分打散菌体加入溶菌酶(1mg) 37水浴保温30-60min，温和摇动20%SDS(1ml，终浓度为2%) 55水浴保温10 min50ul蛋白酶K(50ug/ml) 55水浴保温30-60 min，温和摇动2.5ml 5M NaClO4(使终浓度为1M) 加入等体
14、积P：C：I混合液，充分振荡使其呈乳浊液(约20 min)5600rpm，4，20 min离心,吸取上层水相，重复以上步骤2-3次至没有蛋白膜出现70ul RNase(3070ug/ml) 37水浴保温30-60 min 加入等体积的C：I混合液，充分振荡使其呈乳浊液5600rpm，4，20 min离心 吸取上层水相置于冰浴中，然后加入1/10倍体积冷3M NaAc-1mM-EDTA-Na2及等体积冷异丙醇，使DNA沉淀用玻璃棒绕起DNA丝 置于70%乙醇中，4冰箱过液，以洗涤无机盐和有机溶剂95%乙醇中脱水(10min)后风干 溶于0.1SSC中，纯度检查符合要求后置于-20保存。,3、 D
15、NA纯度，浓度检查如果A260：A280：A230=1:0.515:0.450，则其纯度符合实验要求。如果A280和A230分别与A260的比值大于0.515，0.450，需重复提取DNA步骤中去蛋白质和RNA步骤，使其符合上面比例。DNA浓度要求A260大于2.0(约100g/ml)。,1、 DNA样品的要求 浓度A260=0.2-0.5(溶于0.1SSC中) 离子强度对Tm影响明显，全部供试菌株DNA样品的溶解及Tm值测定中所需SSC缓冲液均需来自同一瓶10SSC母液2、 Tm值的测定 以E.coli K-12菌株的Tm值作参比，以消除温度误差及其它实验误差。采用Lambda Bio 35
16、紫外分光光度计进行测定,（三）热变性法测定菌株DNA中G+C mol%,2.6 G+C mol%计算G+C mol%值在25-75%的范围内，Tm值与G+C mol%之间呈线形关系。在0.1SSC溶液中，G+C mol%的计算公式为： G+C mol%=51.2+2.08Tm(x)-Tm(K)其中Tm(x) 为待测菌Tm值，Tm(K)为E.coli K-12的Tm值。,二DNA-DNA同源性分析,DNA同源性测定是新种描述的一个必要指标，DNA同源性70、Tm5为同一个种,二、实验原理双链DNA分子在加热条件下，两条互补的链可以解开，分离成两条单链，即DNA变性(增色效应)。去除变性因素后，在适宜的条件下，变性DNA的两条互补的单链又可以重新组合成原来的双链DNA分子，这一过程叫DNA的复性(减色效应)。来自不同菌株的DNA单链，只要二者DNA分子的碱基序列具有同源性，它们也会在其同源序列之间互补形成双链（杂交）。细菌DNA同源程度越高，杂交率也越高，反之亦然。,
