《植物组织培养基本技术ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物组织培养基本技术ppt课件（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二章 植物组织培养的 基本技术,第一节 培养基及其配制,一、培养基成分 培养基：供植物材料生长的人工配制的基质。 （一）水分：母液及培养基配制时，要用蒸 馏水，但大规模生产时，可用自来水代替。 （二）无机元素：根据植物需要量的多少，可分为：大量 元素和微量元素。,1.大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元 素，包括：N、P、K、Ca、Mg、S等。 N：在制备培养基时以NO3-N和NH4-N两种形 式供应。常用含N物质有KNO3、NH4NO3、 (NH4)2SO4 P：常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。 K：常用的物质有KCI、KN03、 KH2P04 Ca、Mg、S： MgSO4
2、7H20、 CaCl22H2O,2、微量元素：指小于0.5mmolL的元素，包括 Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。 Fe：常用FeSO47H20，因其在pH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀，通常FeSO47H20 和Na2EDTA结合成络合物使用。 B：H3BO3 Mn，Cu，Zn：常用其硫酸盐； Mo：Na2MoO4 Co: CoCl2,（三）有机营养物质：培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：,1、碳水化合物碳源：可作为碳源的有蔗糖，葡萄糖
3、和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度在2%5%，常用3%（30g/L），即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%。,5.天然有机附加物：如椰汁、香蕉汁、马铃薯汁、酵母提取液等。 （四）植物生长调节剂： 1、生长素类： （1）组培中的作用： 促进细胞伸长； 促进生根； 诱导愈伤组织的形成； 2,4-D会诱导某些植物不定胚的形成。,（2）常用的生长素：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D） （3）常用浓度：0.15.0mg/L （4）需注意的问题： IAA稳定性差过滤灭菌，避光保存； 生长素与细胞分裂素（CTK）配合使用：IAA/CT
4、K比值高，促进根的分化；IAA/CTK比值低，促进芽的分化；IAA/CTK比值始终，形成愈伤组织，不分化 2,4-D可有效诱导愈伤组织的形成，但对芽的形成具有抑制作用，且使用浓度范围较窄，稍过量对植物组织有毒害作用； 诱导分化、增殖和生根阶段一般选用IBA和NAA,2.细胞分裂素（CTK）： （1）作用： 促进细胞分裂； 诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长； 抑制顶端优势，延缓离体组织衰老； 对根的生长一般起抑制作用 （2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）等。 （3）使用浓度：一般0.110.0mg/L,3.其他生长调节剂： （1）GA：赤霉素 作用：
5、a.促进幼苗茎的伸长和不定胚发育为小植株 b.与生长素协同作用，对形成层的分化有影响： IAA/GA比值高时，有利于木质部分化IAA/GA比值低时，有利于韧皮部分化 c.打破休眠 d.抑制器官和胚状体的形成，但二者形成后，又可促进其生长 常用浓度：0.1-0.5mg/L,（2）ABA：脱落酸 a.促进胚状体的发生 b.促进胚状体发育成熟但不萌发 （五）凝固剂：琼脂、卡拉胶等 浓度：一般0.4%0.7% （六）其他物质 1.活性炭（AC）：防止外植体褐变；降低玻璃苗的产生率；有利于生根，一般0.5%3% 2.抗生素： 3.抗氧化物质,三、培养基的类型及特点,1、MS培养基应用最为广泛 （1）特点
6、：无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较高 （2）适用范围：广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,2.White培养基：其特点是无机机盐数量较低，适用于生根培养，胚胎培养及一般的组织培养也可以用，应用较广泛。 3.B5培养基：其主要特点是含有较低的铵，较高的硝酸盐和VB1，铵对植物的生长有抑制作用。木本植物尤其适宜在B5培养基上生长。 4.N6培养基：其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。,三、培养基的配制,（一）母液的配制及保存 1.母液的类型： 大量元素母液（N 、P 、S 、K 、Ca 、Na 、Mg等大量元
7、素的无机盐混合液）10X或20X 微量元素母液（Mn 、Mo 、Co 、Cu 、Zn 、B 、I等微量元素的无机盐混合液）100X 铁盐母液（一般使用螯合铁Fe-EDTA)100X 有机营养母液（各种维生素和某些氨基酸的混合液）100X 植物激素母液（各种植物激素单独配制的母液）100X,2、配制母液的注意事项： （1）配制无机盐母液要防止混合各种盐时产生沉淀，各种药品必须在溶解后才能混合，而且要注意先后次序，把钙离子、锰离子、钡离子和硫酸根、磷酸根错开，以免相互结合生成沉淀。 另外，在混合各种无机盐时，稀释度应大，混合要慢，注意搅拌。,（2）在配制微量元素母液时也应注意药品的添加顺序，以防止
8、沉淀的产生。 （3）铁盐由于易被氧化，易与其他混合液产生沉淀，因此铁盐应与Na2-EDTA混合配制成螯合铁。 （4）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D 、NAA 、IAA 、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。,3、配制好的母液贴上标签标签：注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时应移取的量。注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。,（二）培养基的制备方法,1.确定培养基配方及配制量； 2.根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼脂的用量。 3.按需吸取母液、称
9、量蔗糖和琼脂。 4.用60%-70%培养基最终容积的蒸馏水将琼脂煮溶。 5.分别加入各种母液和糖，一些不耐热的激素在灭菌后用过滤灭菌法加入。,6.加蒸馏水定容至最终容积，调PH值。 7.分装 8.包扎 9.瓶身上做标记 10.高压灭菌 ：0.105 MPa，121，2030min,（三）计算： 1.欲配制1L MS6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知 MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐100倍，有机物500倍， 1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。 （1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量 （2）
10、叙述培养基的配制过程,2.要配制1mol/L NaOH 100ml，1mol/L HCl 1000ml，则需称取 NaOH 多少克，量取浓HCl 多少ml？ 注：NaOH的摩尔质量是40g/mol，浓盐酸的摩尔浓度为12mol/L,第二节 外植体的选择与消毒,一、外植体的类型 (一）外植体的选择原则 1.植物的基因型：决定植物组织培养难易程度的重要因素； 2.外植体的生理状态和发育年龄 3.取材的季节 4.外植体的大小 5.外植体的来源 6.易于消毒,（二）外植体的类型 1.带芽的外植体适于离体快繁，脱毒培养 2.分化的器官和组织 3.种子和胚,二、外植体的消毒,1.外植体预处理： （1）适当
11、修剪： 茎段：将茎上的叶片、叶柄等剪去，将茎剪成带有23个节的茎段； 叶：大叶剪成带叶脉的叶块； 根：修去老根死根等，剪成25cm的根段。,（2）如茎、叶外被茸毛、蜡质、不光滑等，则用软毛刷蘸洗衣粉水刷洗 （3）流水冲洗 2.70%乙醇浸泡1030s，无菌水冲洗1次 3.选择合适的消毒剂，浸泡适当时间 4.无菌水冲洗35次,第三节 灭菌消毒技术,一、物理灭菌方法： （一）高温灭菌： 1.高压蒸汽灭菌 （1）设备：高压蒸汽灭菌锅 （2）特点：简便、迅速、灭菌彻底 （3）适用范围：耐高压高温的培养基、无菌水、无菌纸、接种工具、培养容器等 （4）要求：0.105MPa、121、2030min,2.灼
12、烧灭菌： （1）设备：酒精灯 （2）特点：简便、迅速 （3）适用范围：接种工具 （4）要求：用酒精灯外焰灼烧,3.干热灭菌： （1）设备：电热干燥箱、接种器械灭菌器 （2）特点：干燥、但耗时较长 （3）适用范围：金属接种工具 ，玻璃培养容器 （4）要求：160170，12h，如有玻璃器皿则必须待温度降至50时，才能打开烘箱门，以防温度骤降玻璃破碎。,（二）紫外线灭菌：紫外灯，适于接种室、培养室及超净工作台的空气和物体表面灭菌。 （三）过滤灭菌：细菌过滤器、注射器，适用于高温高压下易分解的试剂，主要是植物生长调节物质，如IAA、GA3、ZT的灭菌。,二、化学方法,（一）适用范围：适用于外植体表面
13、、接种器械表面、环境、空气和操作人员皮肤的消毒。 （二）常用化学消毒剂,第四节 接种与培养技术,一、接种 1.定义：把无菌的培养物或经过表面消毒后的外植体，转移到新鲜培养基上的过程。 2.注意事项： （1）接种过程中要树立无菌意识，保证无菌操作； （2）操作迅速。,3.无菌操作技术： （1）实验器具和材料的准备 （2）用70%的酒精擦拭超净工作台，开超净工作台和室内紫外灯。 （3）关紫外灯、打开风机，过510分钟进入缓冲间。 （4）用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具。 （5）进行外植体的消毒与接种 （6）完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手,二、植物组织培养条件,一、温度一般为2030。喜温性植物如茄科、禾本科、兰科等2628 ，冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等1822 。培养室。一般设置（252）。 二、光照 1.光照强度 一般为20003000lx 2.光质： 一般在419467nm 3.光周期: 16h的光照，8h的黑暗。,三、湿度一是 培养器皿内的湿度条件二是培养环境的湿度条件70%80% 四、气体氧气；废气,作业,1.培养基的成分包括哪些？ 2.配制母液时应注意什么？ 3.植物生长物质为什么要单独配制母液？ 4.详细论述培养基的配制过程。,谢谢聆听！,
